Tytul: Genetyka Autor: Praca zbiorowa Przedmowa Celem niniejszego podręcznika jest zapoznanie studenta z najważniejszymi zagadnieniami i ů kierunkami rozwoju genetyki medycznej. Autorzy majš nadzieję, że genetyka medyczna, traktowana dotychczas zdawkowo w nauczaniu przyszłych polskich lekarzy i nie uwzględniana w zasadzie w planie studiów, po kilkunastnletnich zaniedbaniach otrzyma nleżne jej miejsce w nowym zreformowanym programie nauczania w polskich akademiach medycznych. Podanie bowiem chociażby podstawowych wiadomoœci z zakresu gen-etyki klinicznej jest konieczne, aby wykształcić lekarza majšcego pełne spojrzenie na patogenezę, leczenie i profilaktyę chorób. Mam nadzieję, że podręcznik ten, pomimo wielu braków, będzie istotnym krokiem w rozwoju genetyki medycznej w naszym kraju, a to, że jest pierwszy, stanowi nie tylko częœciowe usprawiedliwienie jego niedoskonałoœci, lecz także jest zapowiedziš ukazania się dalszych jego wydań, dajšcych pełniejszy obraz tej szybko rozwijajšcej się dyscypliny wiedzy. Jest moim miłym :obowišzkiem podziękować za cerme uwagi i sugestie dotyczšce niniejszej ksišżki: Pani Profesor Danucże Rożynkoz.uej, Panu Profesorowi Atotzże7n,u Horstozuż, Panu Profesorowi Jacko'u>ż Pżetrzykawż oraz Panu Profesorowi Ignacen,u Waldowż. Kzysztof Boczkotuskż Warszawa, 2 V 1988 Spis treœci I. Znaezenie genetyki w praktyce lekarskiej (P. Czerski) . . . 11 Rożwój i znaczenie genetyki medycanej . . . 12 Podział chorób genetycznych. . . 13 Genetyczne obcišżeiiie populacji . . . 16 Częstoœć występowania chorób genetycznych . . . 16 Stopień obcišżenia chorobš genetycznš. . . 20 Farmy i możliwoœci opieki genetycznej . . . 22 Podsumowanie. . 23 II.Informacja genetyczna (K. Boczko2tski) . . . 25 Przekazywanie imformacji genetycznej komórkom potomnym . . . 25 InterEaza . . 26 Przebieg mitozy . . 27 Przebieg mejozy . . . 28 Porównanie mitozy i mejozy. . 35 Chemiczny œkład chromasomów i rola DNA . . 3B Realizacja inforrnacji genetycznej . . . 38 Mutacje . . . 42 Struktura chramatyny. . . . 43 Podsumowanie. . 44 III.Chromosomy człowieka i ieh aberracje (K.Boczkowsk„). . . 45 Licżba i kształt chramosomów . . 45 Ksżtałt chromosomów, . 45 Prawidłowy kariotyp człowieka. . . 46 Aberracje chromosomów i ich powstawanie . . 48 Aberracje sńrukturalne . . . 49 Aberracje liczbowe . . 54 Zapisywanie wyników badań cytogenetycznych . . . 5B Metody badania chromosomów. . 61 Podsumowanie. . 62 IV.Aberracje chromoœómów płciowych (K.Boczkawski) . . 63 Genetyczna determlnacja płci . . 64 Chromatyna pł„owa . . 66 Chrornatyna łciowa X Ciałko Y . . . 69 Genetycżxsa rola heterochromatyny . . 70 Zespół Klinefeltera . . . 71 Badania cytogenetyczne . . . 72 Pochodzenie dodatkowego chromosomu X. . 73 Wiek rodziców. . 74 MężczyŸni XX. . 75 Mężczytni XYY. . 77 Kobiety XXX. . . 77 Zespół Turnera . . . 78 Etiologia i ptogeneza. . Bdania cytogemetycme . . . 80 Pochodzenie chromosomu X. . . . 84 Czyta dysgenezja gonad. . . , . . . 85 Zespół niewrażliwoœci na .ndrogeny . . . . 8B Podsumowanie. 7 V. Aberracje autosomalne (K. Boczkowski) . Zespół Downa. Translokacja zrównoważana. . . . 92 MozaikowoœE . . . . 93 Rodzinne występowanie zespołu Downa. . . 93 Badania ermatoglificztse. Współistnienie zespołu Downa i zpołu Klinefeltera. . . 94 Zwišzek zespołu Downa z „iałaczkš. . ZależnoœE zespołu Downa od wieku matki lub ojca. Ryzyko urodzenia drugiego dziecka z zespołem Downa. . . Trisomia chromosomów a>r 13- zesrpbł Pataua. Trisomia chromosomów nr 18- zespół Edwardsa. . Delecja ramion krótkich chromosombw nr 5- zespół "cri du chat" . . 101 Inne zespoły autosomalne . . .101 Aberracje liczbowe. . . . . 101 Aberracje strukturalne . . . 101 Triploidia d tetraploidi . . . . 102 Procesy nowotworowe . . . . 102 ftodzinne występowanie aberracji chronxsoswmalnych. .. . 105 Podsumowańie. . . . . 105 VI.Badenia cytogenetyczne w wybranych grupach populac,jn,ch (K.Bocz- kowskl7 . . . . lOB Badania cybogenetyczne płodów z poronień samoisbnych. . . IOB Badania cytogenetyczne u noworodków . . . . 109 Badania cytogenetyczne u siedmi- i oœmioletnich dzieci. . . I10 Badania cytogenetyczne u osób nie przystosowanych społecznie oraz u osób upoœledzonych umysłowo . . . 111 Podsumowanie. . . . . 112 VII.Dziedziczenie jednoenowe (J.Zaremba) . . . 113 Odkrycia Mendla. . . . 113 Dziedziczenie autosomalne dominujšce i recesywne. . . . 114 Dziedziczenie 5przężone z płciš.. . . 119 Wybrane zagadnienia dotyczšce dziedzlczenin 7nogenawego . . . 122 Proporcja genetyczna - sposób uwalniania się od błGdu nelokcji. . 122 Kodominacja . . . . 124 Mutacje. . . 125 Niezależna segregacja,rekombinacja d apężeie. . . . 128 Mapowanie genów w genomie człowieka. . . . 129 Liczba genów datychczas zidentyfikewanych u człowiekn. . . . 130 Podsumowanie . . . 131 VIII.Uwarunkowanie wieloczynnikowe (I. wald). . . . 132 Genetyka cech iloœciowych a genetyka mendlowsk:a. . . . 132 Badanie blitništ . . . . 133 Badanie dzieci adoptowanych . . . . 134 Miary stosowane w analizie cech uwarunkowanych wieloczynnikowo . 13B PVlodele wieloczynnikowego uwarunkowania chorbb . . . . 138 NiejednorodnoœE genetyczna. . . . . 141 Podsumowanie. . . . . 143 IX.Czynnihi genetyezne w patogenezie chorób (1.Wald) . . . . 144 DziedzieznoœE a œrodowisko.Ich zola w procesie powstawania choroby . 144 Poziomy analizy chorób genetycych. . . . 14B Patologia molirularna - hemoglobinopatie . . . . 147 Enzymy i inne białka . . Defekty strukturalne. Postępy genetyki a klasyfikacja chorób . Genetyka a nowotwarzenie . Postępy gnetyki a diagnostyka . Postępy genetyki a leczenie. Podsumowanie. X. Analiza rodowodów (E. Manikot.ska-Czerska). . Zbieranie i zapis danych rodzinnych . . Przykłady analizy rodowodów. . Dziedziczenie cech autosomalnych recesywnych Dziedziczenie cech autosomalnych dominujšcych . . Dziedziczenie cech kodominujšcych i cech poœrednich . Dziedziczenie cech sprzężonych z chromosomem X . Dziedziczenie nieregularne . . Fenotyp a analiza rodowodu. Sprzężenie cech a analiza rodawodu . . Podsumowanie. XI. Genetyka populacyjna (1. Wald) . Podstawowe pojęcia . Prawo Hardy'ego i Weinberga. . PolimorEizmy genetyczne. . Czynniki wpływajšce na odchylenie od równowagi genetycznej. . . Spokrewnieie w populacji . Genetyka populacyjna i ewolucja . Podsumowanie. XII. Immunogenetka (A. Czlonkol.vslca) . Genetyczna kontrola syntezy immunoglobulin. . Budowa immunoglobulin. Determinanty antygenowe immunoglobulin . Geny odpowiedzialne za syntezę przeciwciał . Antygeny grupowe . Grupy krwi . Układ zgodnoœci tkankowej. . Geny kodujšce receptor dla antygenu na limfocytach T. Podsumowanie. XIII. Farmakogenetyka i ekogenetyka (1. Wald). Podstawowe pojęcia . Warianty jednogenowe i w„eloczynnikowe. Lki a choroby uwarunkowane genetycanie . . Ekogenetyka . Podsumowanie . XIV. Poradnictwo genetyczne (P. Czerskż, E. Mnnżkowska-Czerska) . . . Weryfikacja lub ustalenie rozpoznania. . Ustalenie toku dziedziczenia choraby . . Zastosowan„e teorii prawdopodobieństwa w poradnictwie genetycznym Genotyp pacjenta. Okreœlenie prognozy genetycznej . Okreœlenie prognzy genetycznej w chorobach jednagenowych . . Frognoza genetyczna w małżeństwach spokrewnianych Okreœlenie prognozy genetycznej dla pacjentów obcišżonych aberracjš chromosomalnš lub chorobš wielogenowš . . Porada genetyczna . Podsumowanie. XV. Diagnostyka prenatalna (L. Wżœnżet.skf) . Ocena kariotypu pło„u . . Zastosowańie b3opsji trofoblastu w diagnostyce prenatalnej. . . . Rola ultrasonogr.afii w diagnostyce prenatalnej wad oœrodkowego układv nerwowego. 227 228 229 230 231 234 236 Alfa-fetoproteina w diagnostyce otwartych wad oœrodkowego układu nerwowego. AktywnoœE acetylocholinoesterazy w płynie owodniowym w wadach oœrodkowego ukł,adu nerwowego. . Diagnostyka blk„w metabolicznych i schorzeń uwarunkowanych genetycznie . Zaburzenia przem;iany lipidów . Zaburzenia przemiany węglowodanów . Zaburzenia przemiany aminokwasów . Zaburzenia przemiany mukopolisacharydów . Scharzenia sprzężone z chromosomem X . Schorzenia o nie ustalonej etiologii. Fetoskopia. Badanie płodu. . . Powikłania . . Podsumowanie. . . XVI. Zastosowanie metod genetyki molekularnoj w diagnostyco chorób genetycznych (P. Czerskt). . Zasady technik rekombinacji DNA. Zastosowanie rstryktaz. . Konstrukcja b'ibliatek i sond DNA. Klonowanie. Techniki hybrydyzacji . . Zastosowanie œond DNA i hybrydyzacji. . Cytogenetyka przepływowa . Podsumowanie. . . Słownik najczęœciej używanych terminów genetycznych (K. Boczkottski.). . Literatura uzupełniajšca. . Skorowidz rzeczowy. . I. Znaczenie genetki w praktyce lekarskiej Przemysaw Czeski Znajomoœć współczesnej genetyki jest nieodzowna do rozumienia zjawisk biologicznych, w tym fizjologii i patologii człowieka, które stanowiš podstawę praktyki lekarskiej. Wszystkie ceehy danego organizmu powstajš na podłożu informacji genetycznej, przekazanej przez organizmy rodzicielskie. Podczas rozwoju osobniczego i całego życia poszczególne obszary informacji genetycznej sš odczytywane i zostajš zrealizowane w postaci cech trukturalnych i czynnoœciowych. Mówi się o procesie wyrażania (ekspresji) cech, który podlega wpływom œrodowiska. Realizacja żnformacji genetycznej (a niekiedy i treœć tej informacji) jest modyfikowana przez czynniki œrodowiska. Toteż podstawę rozumienia procesów biologicznych stanowi znajomoœć mechanizmów przekazywania cech dziedzianych i realizacji informacji genetycznej oraz interakcji pomiędzy tymi mechanizmami i czynnikami œrodowiska. Wiedza ta powinna służyE rozumnym próbom modyfikowania przebiegu tych procesów. Zapobiegawcze i lecznicze postępowanie lekarskie nie jest zaœ niczym innym, jak takš próbš. Każdy lekarz powinien więc uxnieć myœleć "genetycznie". Umiejętnoœć takiego myœlenia nabiera coraz to większego znaczenia w miarę gromadzenia wiedzy o interakcjach podłoża genetycznego z czynnikami œrodowiska oraz w miarę wprowadzańia zmian w œrodowisku życia i pracy na skutek postępu technicznego. Reakcje ustroju na czynniki œrodowiskabiologiczne, chorobotwórcze (wirusowe i bakteryjne), żywieniowe, chemiczne, fizyczne - podlegajš genetycznej kontroli. Stšd też istotne jest, aby każdy lekarz - majšc do czyńienia z indywidualnym pacjentem - umiał dostrzec genetycznie uwarunkowanš swoistoœć odczynów jego organizmu. Majšc zaœ do czynienia z grupš ludzi, należy umieć zidentyfikować osoby ponoszšce ze względów genetycznych zwiększone ryzyko zachorowania na okreœlone choroby. Równie istotna jest umiejętnoœć identyfikowania osób i rcdzin, ponoszšcych okreœlone ryzyko genetyczne, to jest ryzyko przekaz„ńia chorób genetycznych potamstwu. Osobne zagadnienie stanowi umiejętnoœć właœciwego zaszeregowania okreœlonych chorób i zespołów do grupy chorób genetycznych. We wszystkich starszych i w wielu współczesnych podręcznikach medycznych niedostatecznie omówiono choroby genetyczne, a niekiedy wręcz pominięto genetyczne podłoże wielu chorób. Wynika to z tego, że dynamiczne postępy genetyki medycznej nie zdšżyły jeszcze w pełni przeniknšć do podręczników poszczególnych specjalnoci. ll ROZWÓJ I ZNACZENIE GrENETYKI MEDYCZNEJ W išgu ostatnich trzydziestu lat genetyka medyczna rozwijała się niezwykle szybko. Obecny stan tej dżiedziny pozwala przewżdywać jej dalszy dynamiczny postęp przez następne 10 lub 20 lat. Rozwój ten jest zwišzany z postępami wiedzy w zakresie nauk odstawowych oraz z ogólnym postępem technicznym i ekonomicznym. Trzy czynniki odgrywajš szczególnš rolę w rozwoju genetyki medycznej. Z punkhu widzenia lekarza praktyka najważniejszym z tych czynników jest wzrastajšce zapotrzebowanie na genetycznš opiekę zdrowotnš, obejmujšcš diagnostykę, leczenie, rehabilitację i profilaktykę chorób genetycznych wraz z poradnictwem genetyeznym. Zjawisko to występuje szczególnie wyraziœcie w krajach rozwiniętych, w których zostały apanowane choroby pasożytnicze, bakteryjne, wirusowe i z niedożywienia, w zwišzku z tym wzrasta względna częstœć chorób genetycznych. Paprawa warunków bytu i pozromu lecznictwa powoduje wydłużanie się okresu życia osób chorych genetycznie. Uprzemysłowienie, nowe technologie i chemizacja produkcji żywnoœci wprowadzajš do œrodowiska pracy i życia codziennego wiele dotychczas nie spotykanych czynników, z których liczne dzialajš mutagennie. Tak więc choroby genetyczne i ich profilaktyka wysuwajš się na czoło problemów zdrowotnych w krajach rozwiniętych. Korzystajšc z ich doœwiadczeń, kraje rozwżjajšce się eoraz szerzej uwzględńiajš genetykę medycznš w ochronie zdrowia. Drugim, równie istotnym czynnikiem sš postępy wiedzy w zakresie biologii, genetki ogólnej i molekularnej oraz genetyki człowieka. Doprowadziły one nie tylko do lepszego zrozumienia mechanizmów dziedżiczenia i genetycznej regulacji czynnoœci komórki, ale stworzyły również możliwoœci sterowania tymi procesaxni. Zasadnrczym zmianom uległy poglšdy na fizjologię cłowieka, interakcje arganizmu z czynnikami œrodowiska zewnętrznego i patogenezę wielu chorób. Wyodrębniono wiele nowych jednostek chorobowych i opracowano nowe zasady postępowania leczniczego. Omówienie tych przemian przekracza ramy tego rozdziału i tej ksišżki. Najlepœze podsumowanie można znaleŸć w materiałach 51 Symposium Cold Spring Harbor Laboratory na temat biologii molekularnej czowieka. Postępy genetyki omówione sš w ksišżkach Watsona * oraz Lewina **. Trzeba podkreœlić, że wszystkie te osišgnięcia nie byłyby możliwe bez zastosowania zdobyczy współczesnej elektroniki i naukż o komputerach, w rozwoju której niemałš rolę odegrała polska myœl matematyczna. Logika stosowana w popularnych komputerach firmy Hewlett-Packard wywodzi się z Polski. Trzecim wreszcie czynnikiem jest w wielu krajach szybkie tempo wdrażania do praktyki nowych postępów nauk podstawowych. Badania nad rekombinacjš kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) doprowadziły do opracowania szybkich i prostych technik, których zastsowania praktyczne sš jednym z podstawowych elementów ewnlucji biotechnologicnej w przemyœle. Zastosowanie metod i produktów biotechnolog'ii w rzxtynowych laboratoriach medycznych i w leczeniu radykalnie zmienia postępowanie diagnostyczne i terapeutyczne. 2mudne i wysoce wyspecjalizowane metody laboratoryjne, stosowane dotychczas w badaniach podstawowych, stały się podstawš do opracowania szybkich, prostych i w znacznym stopniu zautoma * Watson J. D. i wsp.: Molecular Biology of the Gene. Bemjamin CummingsPubl. Co., Menlo Park, Ca. VI. 1 1988, vol. 2 1981. ** Lewtn B.: Genes III. John lPiley. New York 1987. 12 tyzowanych testów lub zestawów odczynników diagnostycznych. W latach 1985 i 1986 wprowadzono do diagnostyki rnikrnbiologicznej zestawy do hybrydyzaćji DNA lub DNA/RNA pozwalajšce na identyfikację sekwencji nukleotydów charakterystycznych dla genomu niektórych rodzajów lub gatunków bakterii (np. Mycobacterżum, Mycoplasma, Legionella, Salmonella), a tym samym do stwierdzenia obecnoœci tych drobnoustrojów w badanym materiale. Klasyczne metody badania odpornœci na antybiotyki zostanš zastšpione badaniem obeenoœci i ekspresji genów nadajšcych odpornoœć w bakteriach uzyskanych od pacjenta. Hybrydyzacja DNA i RNA za pomocš zestawów stanie się niedługo podstawowš metodš identyfikacji wirusów. Zaletš tych metod jest ich prostota i mżliwoœć uzyskania wyniku w cišgu godzin, a nawet minut, od momentu uzyskania materiału o badania. Należy przewidywać, że ok. 1990 r. zostanie wprowadzona do handlu œwiatowego pokaŸna liczba zestawów do analizy genomu pacjenta, a tym samym do diagnostyki chorób genetycznych w okresie przedobjawowym, jak np. w iagnastyce prenatalnej lub we wczesnych okresach życia. Wzrasta stale liczba i zmniejsza się cena półautomatyenej lub całkowicie zautomatyzowanej aparatury do genetycznych badań laboratoryjnych. Szerokie zastosowanie koJnputerów do gromadzenia i przetwarzania laboratoryjnych i klinicznych danych genetycznych daprowadziło do atworzenia sieci banków informacji pomocnej w diagnostyce chorób genetycznych. Opracowano liczne programy komputerowe do analizy sekwencji zasad purynowych i pirymidynowych w kwasach nukleinowych i aminokwasów w peptydach oraz do analizy procesów transkrypcji i translacji. Programy te pozwalajš na analizę rekombinacji mejotycznych, przewidywanie efektów okreœlonych mutacji i ustalanie prawdopodobieństwa obecnoœci kreœlonej żnformacji genetycznej (sekwencji nukleotydbw) w NA na podstawie analizy białek. W handlu znajduje się ponad sto genetycznych programów (software) analitycznych, liczba ich stale roœnie. Opraowane zostały programy do analizy wpływu œrodowiska na ekspresję genów i regulację genetycznej czynnoœci komórki. Wzrasta liczba programów do symulacji komputerowej biologicznych doœwiadczeń genetycznych. Matematyczne podstawy analizy sprzężeń dajš się łatwo zastosować do analizy,poszczególnych rodowodów i okreœlania ryzyka genetycznego. Należy przewidywać szybl rozwój komputeryzacji diagnostyki ż poradnictwa enetycznego na œwiecie. PODZIAŁ CHORÓB GENETYCZNYGH Choroby genetyczne można zdefiniować jako upoœledzajšce sprawnoœć życiowš odchylenia od stanu prawidłowego (statystycznej normy), które przekazywane sš jako cecha dziedziczna z pokolenia na pokolenie, lub które powstajš de n,ovo na skutek zmian i zaburzeń w mechanizmach przekazywania cech dziedzicznych. Powstałe de vzovo zmiany mogš być przekazywane potomstwu jako cecha (choroba) dziedzicznli. Podział chorób genetycznych opiera się tradycyjnie na podstawowych prawach dziedziczenia. Wyróżnia się choroby jednogenowe, przekazywane zgodnie z prawami Mendla i uwarunkowane Lreœciš informacyjnš jednego genu, to jest w obrębie pary alleli, występujšcych w okreœlonym locus genowym (patrz rozdział VII - Dziedziczenie jednogenowe). Wœród tych chorbb wyróżnia się autosomalne recesywne, autosomalne dominujšce i sprzężone z chromosomem płciowym żeńskżm X, często kreœlaaze jak.o sprzęmne z płciš. 13 Następnš grupę stanowiš choroby wielogenowe, warunkowane współdziałaniem wielu genów umiejscowionych w różnych loc„. Choroby te nie sš przekazywane zgodnie z prostym dziedziczeniem wg sehematu Mendla. Niejednokrotnie objawy tych chorób występujš na skutek interakcji z czynnikami œrodowiska i ujawniajš się dopiero wówczas, gdy nasilenie działania tych czynników osišgnie pewnš wartoœć progowš. W zwišzku z tym mówi się o chorobach wieloczynnikowych. W wielu podręcznikach okreœlenia choroby wielogenowe i choroby wieloczynnikowe używane sš zamiennie i granica między tymi dwoma grupami jest płynna. Ostatniš grupę stanowiš ehoroby występujšce w zwišzku z nieprawidłowoœciami liczby i struktury chromosomów. Mówi się o chorobacb chromosomalnych lub aberracjach chromosomalnych. Obok powyższej, tradycyjnej, klasyfikacji chorób genetycznych warto jeszcze prowadzić ze względów praktycznych dwa dodatkowe równoległe podziały. Pierwszy z nich wynika z podanej wyżej definicji chorób genetycznych. Wedłu niej można wyróżnie rupę odziedziczonych chorób przekazanych dotkniętej osobie przez jedno lub obydwoje rodziców. Drugš grupę stanowiš choroby genetyczne, które wystšpiły po raz pierwszy w rodzinie u dotkniętej osoby na skutek zaburzeń w mechanizmach przekazywania cech dziedzicznych - œwieżej mutacji lub powstałe de ovo aberracji chromosomalnej. Zaszereowanie okreœlonego przypadku do jednej z tych dwóch grup ma istotne znaczenie dla okreœlenia ryzyka genetycznego, ponoszonego przez danš rozinę. Jeżeli dana choroba została przekazana przez rodziców, to ponoszš oni okreœlone ryzyko genetyczne, że następne dzieci będš dotknięte tš samš chorobš. Natomiast jeżeli choroba zwišzana jest ze œwieżš mutacjš genowš, dominujšcš lub sprzężonš z chromsomem X, t,o rodzice dotkniętej osoby ponoszš genetyczne ryzyko populacyjne, to jest takie samo, jak każda statystyczna para rodziców w danej populacji. Sprawa ryzyka genetycznego jest bardziej złożona w przypadku wystšpienia de novo aberracji chromosomalnych u dziecka (patrz rozdział XIV - Poradnictwo enetyczne). Następnym przydatnym praktyrznie podziałem jt klasyfikacja uwzględniajšca interakcje podłoża genetycznego (enotypu) z czynnikami œrodowiska. Charakterystyczny dla gatunku ludzkiego genotyp, warunkujšcy przystosowanie do œrodowiska i sprawnoœć życiowš, okreœla się jako typ dziki. W abrębie tego typu występujš liczne warianty warunkujšce różnorodnoœć enetycznš (polimorfizm). Nie upoœledzajš one jednak sprawnoœci życiovcTej i nie prowadzš do odchyleń od normy statystycznej. Niektóre warianty genetyczne dajš większš od przeciętnej sprawnoœć życiowš. Inne warianty, warunkujšce odchylenia od normy, zdefiniowane wyżej jako choroby genetyczne, upoœledzajš sprawnoœć życiowš. Zmiany treœci informacji genetycznej, dotyczšcej regulacji podstawowych procesów rózwoju, struktury lub czynnoœ„ organizmu (mutacje genów o dużym efekcie) albo rozległe zxniany w genomie (jak aberracje chromosomalne) ujawniajš się jako nieprawidłowe cechy fenotypu niezależnie od œrodowiska. Wiele zmian w obrębie poszczególnych genów może się zsumować, dajšc upoœledzenie sprawnoœci życiowej i nieprzystosowanie do różnych, często nie zidentyfikowanych, czynników œrodowiska. Zwišzane z tym choroby wielogenowe lub wieloczynnikowe wymagajš dalszych badań. Identyfikacja poszczególnych genów zwišzanych z danymi cechami pozwoli zapewne na interpretację dziedziczenia w ramach praw Mendla i rozszyfrowanie roli czynników œrodowiska w indukcji adchyleń od normy. Pewna grupa defektów 14 jednogenowych powoduje nieprzystosowanie do okreœlonych naturalnych czynników œrodowiska. Przykładem takich charób sš np. fenylokEtonuria, galaktozemia i nietolerancja fruktozy. Teoretycznie proste, a ucišżliwe w praktyce działanie polegajšce na wprowadzeniu odpowiedniej diety, zapobiega powstaniu objawów choroby lub łagodzi je. W fenyloketonurii postępowanie polega na zmianie naturalnego składu aminokwasów w pożywieniu, a w galaktozemii i nietolerancji fruktozy - na eliminacji odpowiednich cukrów. Genetyczny defekt metabolizmu pozostaje jednak na całe życie i jest przekazywany potomstwu. Jest to więc postępowanie zapobiegawcze lub leczen;e abjawowe, nie zaœ przyczynowe. Œcile objawowym leczeniem jest także leczenie substytucyjne polegajšce na podawaniu aktywnych składników w genetycznych defektach układu krzepnięcia (np. hemofilii A) lub układu odpornoœci. Dopiero manipulacje inżynierii genetycznej, polegajšce na wprowadzeniu odpowiednich genów do komórk samatycznych, mogłaby ctanowić próbc leczenia przyczynowego. Takie próby sš w toku w :odniesieniu do zespołu Lescha i Nyhana oraz Taya i Sachsa, jak również wrodzonych espołów ciężkiej kombinowanej niedomogi immunologicznej (niedobór ADA i PMN) oraz chorób hemoliycrnych, zwišzanych z genetycznym defektem hemoglobiny. Manipulacje inżynierii genetycznej w odniesieniu do komórek płciowych lub rozwijajšcego się płodu, chociaż możliwe teoretycznie, sš jednak sprawš odległej przyszłoœci. Następnš grupę staxiowiš warianty genetyczne, w których kontakt z czynnikami nie występujšcymi naturalnie (leki, chemikalia) prowadzi do wyzwolenia objawów choroby, jak np. polekowe zespoły hemolityczne zwišzane z genetycznym wariantem metabolizmu. Różnorodnoœć (polimorfizm) genetyczna leży u podłoża zmiennej predyspozycji do niektórych chorób. W œwietle powyższych rozważań dodatkowo należy wprowadzić ważne z punktu widzenia diagnostyki różnicowej pojęcie fenakopii. Jak już wspomniano, czyrmiki œrodowiska modyfikujš działanie genów. W ewnych sytuacjach może dochodzić do indukcji fenotypu, który nie odpowiada genotypowi osoby wykazujšcej ten fenotyp, odpowiada natomiast okreœlonemu fenotypowi warunkowainemu genetycznie. Tak więc normalnie rozwijajšce się, leczone dietš dziecko z fenylohetonuriš można uważać za fenokopię dziecka o prawidłowym genotypie. Prawidłowy rozwój uzyskano dzięki diecie eliminacyjnej. Genetyczny defekt metaboliczny pozostaje, jestl przekazywany potomstwu i w przypadku dziecka pł„ żeńskiej będzie odbijał się w czasie póŸniejszej cišży na rozwoju płodu. Jest więc rzeczš praktycznie ważnš, aby pamiętać, że leczeniem wyindukowano fenokapię normalnego rozwoju, a nie genetycznie prawidłowy rozwój. Innym przykładem jest embriopatia warfarinowa. Podawanie preparatu warfarin (pochodna kumaryny) w czasie cišży prowadzi do zaburzeń wapnienia koœci na skutek zahamowania syntezy kwasu gamma-karboksyglutaminowego. U dziecka powstaje obraz kliniczny (fenokapia) chorr,d'rozZysplasia pun.ctata; czyli zespołu Conradiego i Hnermanna. Bergstron i wsp. (1972) wykazali, że zespół ten może występować jako choroba dominujšca. Melnićk (1965) podkreœla, że w większaœci rodzin choroba ta jest przekazywana jako cecha recesywna. Hepple i wsp. (1977) apisali rodziny, w których chozdrodysplasżn puctata przekazywana była jako cecha sprzężona z chromosomem X. Rasenfield i wsp. (1962) obserw.owali niektóre cechy zespołu Canradiego i Hnermanna w przypadkach trrsomii chramosomu 18. Za Spanglerem (1971) należy powtórzyć, że zespół Conradiego i Hnermanna jeœt doskonałym przykładem różnoradnoœci gcnetycznego podłoża dla poornie jenolitego zespo 15 łu klinicznego. Jednoczeœnie trzeba dodać, że podobieństwo między tym ze- społem a embriopatiš warfarinowš jest dobrym przykładem fenokopii u ga- tunku ludzkiego. Całoœć tych rozważań ilustruje złożonoœć genetycznej diagno- styki różnicowej. GENTYCZNE OBCIĽENIE POPULACJI Pojęcie genetycznego obcišżenia populacji zawiera w sobie wiele elementów składowych. Należy rozważać częstoœć występowania chor&b genetyeznych, ich skutki dla zdrowia i stopień upoœledzenia sprawnoœci życiowej ("ciężkoœć" choroby), czas przeżycia chorych oraz skutki emocjonalne i ekonomiczne dla dotkniętych osób, ich rodzin i społeczeństwa. Częœć tyeh elementów jest bardzo trudna lub wręcz niemożliwa (skutki emocjonalne) do przedstawienia w sposób iloœciowy. Dla pełnej oceny naieży zaszeregować w kategorie, porównać ze sobš i zsumować "obcišżenia" zwišzane z poszczególnymi chorobami genetycznymi. Powstaje pytanie, jak oceniE i porównać chorobę występujšcš po urodzeniu i prowadzšcš do ciężkiego zaburzenia rozwoju i œmierci w pierwszych latach życia (jak np. mukopolisacharydoza typu I - zespół Hurler), wrodzonš ahorobę powodujšcš u,poœledzenie umysłowe i skracajšcš czas życia do około połowy (jak np. trisomia chromosomu 21 - zesp5ł Downa i chorobQ występujšcš zazwyczaj między 30 a 40 rokiem życia, prowadzšcš stopniowo do głębokiego upoœledzenia, a nieznaczn?e skracajšcš życie (jak np. plšsawica Huntingtona). Oceny te sš zresztš zmienne w czasie. W miarę uzyskiwania nowych możliwoœ„ leczenia lub zapobiegania i zmian kosztów tego postęgowania stopień obcišżenia również ulega zmianom. Nie daje się więc jednoznacznie okreœliE rozmiaru genetycznego obcišżenia populacji ludzlej. CZBTOSC wYBTPOWANIA CHORbB GENETYCZNYCH CzęstoœE wystQpowania chorób genetycznych stanowi podstawowš, wyjœciowš informację. Gdyby ezęstoœć poszczególnych genów w papulacji, częstoœć œwieych mutacji i aberracji chramosomalnych były znane, można by przewidzieE liczbę œwieżych przypadków chorób genetycznych w kolejnych pokoleniach. Znajšc czas przeżycia chorych genetycznie i rozkład grup wiekowych w danej populacji, można by obliczyć liczbę chorych. Niestety; Mrak jest tych danych. Można jedynie posługiwać się fragmentarycznymi, dostępnymi badani.i i na ich podstawie dokonać oceny szacunkowej. Przeglšd literatury œwiatowej wykazuje brak kompletnych rejestrów chorób genetynych. Wštpliwoci budzi miarodajnoœć rozpoznań, wykrywalnoœć i zgłaszalnoœć poszczególnych chorób oraz genetyczne podłoże niektórych rejestrowanych wad wrodzonych. Brak jest danych o okresie przeżycia chorych, sš one odmienne w różnych krajach. Dostępne rejestry -chorób genetycznych wœród żywo urodzonych „zieci nie obejmujš chorób ujawniajšcych się w póŸniejszym wieku oraz genetycznych przyczyn martwych urodzeń i poi'anień samoistnych. Za najbardziej miarodajnš podstawę do oceny częsboœci chorób genetycznych priyjęto prowadzony od ponad 15 lat ż stale aktualizowany rejestr kanadyjskiej prowincji Kolumbia Brytyjska. Dotyczy on żywo urodzonych i abejmuje chareby ujawniajšce się do około 20 roku życia. Rejestr ten posłużył jako godstawa do oszaoowania częstoœci chorób genetycznych u lu dzi przez Naukowy Komitet Skutków Promieniowania Atomowego Organizacji Narodów Zjednoczonyeh (United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation - UNSCEAR) w raportach z 1977 i 1980 r. Dane rejestru zostały skorygowane przez UNSCEAR w œwietle badań częstoœci poszezególnych wybranych chorób genetycznych, zwłaszeza dominujšcych, oraz danych innych rejestrów. Jednym z najlepiej prowadzonych jest węgierski rejestr "wskaŸnikowych" wad wrodzonych (Czeizel, 1978). Obejmuje on wady i choroby wrodzone jednoznacznie rozpoznawalne w cišgu pierwszych 6 dni życia, a mianowicie bezmózgowie, rozszezep kręgosłupa, wodogłowie, rozszezep podniebienia i wargi, zaroœnięcie przełyku, zaroœnię„e odbytu, nieZstšpienie jšder, niedorozwój końezyn, wrodzone zwichnięcie stawów biodrowych oraz zespół Downa. Sš to sprawy o różnorodnym podłożu genetycznym i uwarunkowaniu czynnikami œrodowiska. Wprowadzono również poprawkę na ezęstoœć występowania aberracji chromosomalnych na podstawie badań noworodków. T a b e 1 a 1. Częstoœó występowania chorbb genetycnych na 100 żywo urodzonyeb n podstawie rejestru Kolumbii Brytyjskiej po poprawkacb UNSCEAR ' 0 , O á G o ai 'b  0 rbdło ' ó u - . .N 0 U N  , Ń ó ' 0 'd O G,: cn N G N z v Gů UNSCEAR 0,12 0,11 0,20 4,28 4,73 9,10 9,44 UNSCEAR szacunek 1,00 0,10 0,40 4,30 4,70 9,00 10,50 1982 ' CzęstoœE aberracji chromosomalnych jest bliższa 0,60%, jeżeli wliczyE 0,19% aberracji strukturalnych nie znajdujšcych odbicia w fenotypie (aberracje euploidalne, jak translokacje zrównoważone i aberracje typu fuzji centryeznych, gdy przy aneuploidalnej liczbie modalnej wszystkie chromosomy sš w zasadzie obecne). Tabela 1 przedstawia częstoœć chor„b genetycznych wœród żywo urodzonych według aktualnego szacunku UNSCEAR z 1982 r. w porównaniu z ocenš z 1977 r. - Dane węgierskie obejmujš częœciowo urodzenia martwe, jak np. bezmózgowie. Czeizel i wsp. (1978) podajš, że wœród dzieci ze zgłosonymi wadami wrodzonymi od 7,5oo do 8,5% wykazywało liczne wady wrodzone (tzw. wielowadzie). Odpowiada to częstoœci od 0,26 do 0,29 na 100 wszystkich urodzeń. Większoœć przypadków licznych wad wrodzonych odpowiadała poważnym uszkodzeniom prowadzšeym w 6,9o/ do martwych urodzeń, a w 45% do œmierci w pierwszym raku życia. Leck (1977) oceniał częstoœć ciężkich, głęboko upoœledzajšcych wad wrodzonych i wad prowadzšcych do œmierci we wezesnym okresie życia na podstawie danych brytyjskich. Według tego autora w 2,44% wszystkich urodzeń dzieci sš obarezone ciężkimi wadami. Powyższa dyskusja wykazuje trudnoœci porównywania danych różnych autorów. Stosowane sš różne kryteria do okreœlenia ciężkoœci wady (choroby) 9 - Zarys genetyh! oraz różne podstawy do obliczania częstoœci - wszystkie urodzenia, tylko żywe urodzenia lub martwe urodzenia. W tym ostatnim przypadku dane ulegajš zmianom, jeœli uwzględnia się porody o czasie, przedwezesne i niewezesne. Odsetek poronień samoistnych z przyczyn genetycznych jest zapewne bardzo duży, ale dokładnie nie jest znany. Rozważajšc dostępne piœmiennictwo, dane UNSCEAR należy przyjšć jako najbardziej miarodajne i wyważone. Należy jednak poczynić kilka zastrzeżeń. Dane te dotyczš tylko żywo urodzonych i chorób ujawniajšcych się w cišgu pierwszych 20 lat życia; reprezentujš one minimum i będš w cišgu najbliższych lat korygowane. Już obecnie należy stwierdzić, że ezęstoœe aberraeji chromosomalnych jest większa. Należy przyjšć, że wynosi ona co najmniej 0,6%; w tym 0,14% trisomii autosomalnych, 0,19/o strulsturalnych aberracji euploidalnych (typu Robertsona i zrównoważonych), O,0 - jo aneuploidalnych aberracji struktury autosomów i 0,22% aberracji chromosomów płciowych. Serie badań noworodków i niemowlšt przeprowadzane w różnych krajach dajš odmienne wyniki; stwierdzono od 0,47% (Kanada) do 0,83/ (Dania) przypadków aberracji chromosomalnych wœród żywo urodzonych. Zastosowanie technik pršżkowych barwienia chromosomów i nowych metod o dużej zdolnoœci rozdzielcej zapewne zwiększy jeszeze ocenę częstoœci występowania aberracji. Szezególnie dotyczy to aberracji nie znajdujšcych odbicia w fenotypie lub zmieniajšcych cechy w niewielkim stopniu. Należy dodać, że przynajmniej w dwóch okolicach œwiata, w Danii oraz w obrębie miasta Nowy Jork, zaobserwowano w cišgu ostatnich 20 lat stały powolny wzrost częstoœci aberracji chromosomalnych, zwłaszeza trisomii 21. Wzrost ten nie daje się wytłumaczyć lepszš wykrywalnoœciš i zgłaszalnoœciš przypadków. Neel (1978) uważa, że szacunek UNSCEAR jest zaniżony w odniesieniu do częstoœci chorób jednogenowych. Liczba jednostek stale wzrasta, gdyż identyfikuje się cišgle nowe choroby. Można założyć, że nie zidentyfikowano dotychezas wszystkich chorób jednogenowych. Podstawę do tego stwierdzenia stanowi następujšce rozumowanie. Większoœć klasycznyeh recesywnych chorób metabolicznych wišże się z nieobecnaœciš lub brakiem prawidłowego działania (całkowitym lub prawie całkowitym) enzymów, białek transportowveh lub receptorowych. Obecnie u człowieka znanych jest ponad 5000 różnych białek, których nieobecnoœć lub zmiany czynnoœciowe mogš prowadzić do recesywnych chorób metabolicznych majšcych podobny charakter, jak znne i opisane do tej pory. Lxezba zaœ znanych i opisanych cech i chorób !ztosomalnych recesywnych wynosi obecnie ok. 1300. T a b e 1 a 2. Częstoœe niektórych dominujšey ch autosomalnych cborób genetycznych na 1000 żywo urodaonych (dane różnych autorów, œrednio) Choroby CzgstoœE wYstępowania Plšsawica Huntingtona O,„ Neurofibromatosis Dystrofia miotaniczna Torbielowatoœ nerek 0 g lepota dominujšca 0,1 Głuchota postaE wezesna dziecięca 0,1 postać póŸna (otoselerosis) dorosłych 3,0 Hipereholesterolemia 2,0 Sferocytoza wrodzona 0,2 Dentżnoettesis imperfecta 0,1 Osleoenesfs imperfectn 0,04 Zespó Marfana 0,05 18 Szacunek UNSCEAR stanowi więc dolnš granicę częstoœci chorób genetycznych i z czasem będzie ulegać podwyższeniu. Rozpiętoœć danych podawanych w literaturze ilustruje szacunek częstoœci chorób geetyeznych podany przez Galjaarda (1980). Wedlug tego autora wœród żywo urodzonych choroby autosomalne dominujšce występujš w iloœci od 0,06 do 0,7%, sprzężone z chromosomem X - od 0,03 do 0,07%, autosomalne recesywneod 0,09 do 0,25%, aberracje chromosomalne w 0,5oo. Tabela 2 podaje częstoœć występowania wybranych chorób. Jak już wspomniano, udział chorób genetyanych w etżologii martwych urodzeń i poronień samoistnyeh nie jest nany. Dostępne miarodajne dane dotyczš tylko aberracji ehromosomalnych. Należy uważać, że przynajmniej 50% poronień samoistnych wišże się z aberracjš chromosomów u płodu (UNSCEAR). Galjaard (1980) podaje od 50 do 60% aberracji chromosomalnych w poronieniach samoistnych jako szaeunek oparty na danych piœmiennictwa œwiatowego. Autor ten chyba przecenia role aberracji chromosomalnych w stratach cišży, podajšc, że połowa zapłodnień końezy się (uwzględniajšc straty przedimplantacyjne) niepowodzeniem cišży z powodu aberracji chromsomalnych. Rola ich jest jednak istotna. T a b e I a 3. Częstoœó niektórych chorób recesywnych na 1000 żywo urodzonych (dane różnych autorów, œrednio) Choroby CzęstoœE występowania Auosomalne Mukowiscydoza 0,4 Głuchota (różne postaci) 0,5 Slepota (różne postacf) 0,2 Fenyloketonuria 0,08 Galaktozemia 0,025 Mukapolisacharydozy (różne postaci) 0,04 Glikoenozy 0,02 Sprzężone z cromoomem X Dystrofia mięœniowa Duchenne'a 0,14 fiemofilia A 0,01 Dane przytoczone wyżej oraz w tab. 3 odnoszš się przede wszystkim do populacji europejskij i północnoamerykańskiej pochodzenia europejskiego. Populacje o okreœlonym pochodzeniu etnicznym lub zamieszkujšce niektóre rejony mogš wykazywać odxnienne częstoœci występowania chorób genetycznych. Tak więc częœtoœć hemoglobinopat (np. niedokrwistoœci sierpowatokrwinkowej) jest większa u Murzynów, natomiast rzadziej występujš u nich aberracje chromosomalne. Wady eewy nerwowej występujš częœciej wœród ludnoœci Walii, Szkocji i Irlandii niż w innych rejonach Eurapy i wœród Irlandczyków zamieszkałych w Ameryce Północnej. Chroba Taya i Sachsa (gangliozydoza GM 2 - typ I) występuje u Żydów Aszkenazyjskich ok. 100 razy częœciej niż wród innych grup ludnoœci. CzęstoEć występowania chorób genetycznych jest zmienna w czasie i Carter uważa, że np. aberracje ehromosomaine wykazujš wahania sezonowe. Niemniej można przyjšć, że dane UNSCEAR i zawarte w tabeli 3 w przybliżeniu charakteryzujš gatunek ludzki. Należy jednak pamiętać o odehyleniach od tych wartoœci zależnych od pochodzenia etnicznego, sposobu kojarzenia par (np. wpływ spokrewnienia małżeństw wœród geograficznych lub kulturowych izolatów) i rejonu geograficznego (wpływ œrodo - ka?). Na pytanie, w jakim stopniu dane te odnoszš się do populacji polskiej, nie można udzielić jednoznacznej wišżšcej odpowiedzi. Dostępne sš bowiem fragmentaryczne badania dotyczšce występowania chorób genetycznych wœród różnych, niewielkich stosunkowo populacji w różnym wieku, zamieszkałych w różnych rejonach kraju. Przykładowo można wymienić badania prowadzone w Instytucie Pediatrii w Krakowie (Pietrzyk i wsp.), Instytucie Matki i Dziecka (choroby metaboliczne - Cabalska, Bożkowa i wsp.) i Instytueie Psychoneurologii (Wald, Zaremba ż wsp.). Ponadto istnieje kilkadziesišt fragmentarycznych publikacji. Instytut Matki i Dziecka (Zakład Ochrony Zdrowia - Kukla i wsp., Zakład Epidemiologii - Wiórowa, Tesarz, Sztachelska i wsp.) prowadzi od wielu lat analizę œmiertelnoœci i przyczyn zgonów niemowlšt. Badano również zachorowalnoœć, przyczyny hospitalizacji dzieci i występowanie niektórych chorób genetycznych (np. wrodzone wady serca - widerski, Tesarz) wœród różnych wybranych populacji. Wszystkie te publikowane i częœciowo zawarte w wewnętrznych publikacjach dane pozwalajš na następujšce stwierdzenia: 1) wœród populaeji polskiej częstoœć występowania chor&b genetycznych (w tym wieloczyrmikowe wady wrodz:one) nie odbiega od szacunku UNSCEAR, nie stwierdzono przynajmniej rażšcych udehyleń od częstoœci występowania tych chorób wœród populacji europejskiej ; 2) można przyjšć, że ok. od 2,5% do 3% dzieci rodzi się z ciężkimi genetycznymi npoœledzeniami; od 0,5oo do l% ginie w pierwszym roku życia, a więc ok. 2% wkracza w drugi rok życia z tymi obcišżeniami; 3) nie analeziono charakterystycznych dla polskiej populacji (lub subgopulacji regionalnych) chorób wielogenowych i wieloczynnikowych (wad wrodzonych) lub chorób jednogenowych; badane nieliczne choroby jednogenowe (przede wszystkim fenyloketonuria, galaktflzemia, hemofilie) występujš z tš samš częstoœciš co w innych populacjach europejskich; być może mukowiscydoza (dane Instytutu Matki i Dziecka) występuje nieznacznie częœciejwymaga to jednak dalszych badań; nieprawidłowoœei hemoglobiny sš niezwykle rzadkie ; 4) częstoœć aberracji chromosomalnych, łšczna i w zakresie poszezególnych typów, jest taka sama jak w innych populacjach europejskich; 5) częstoć występowania poszezeg&lnych chorób genetycznych w poszezególnych rejonach kraju wymaga przeprowadzenia wieloletnich miarodajnych badań, jest to sprawa o istotnym znaczeniu praktycznym. STOPIEl1 OBCIĽENIA CHOftOBĽ GENETYCZN Stopień obcišżenia chorobš genetycznš jest bardzo trudny do ujęcia w wymiernych kategoriach. Nie można okreœlić iloœciowo dramatu rodziny majšcej upoœledzone dziecko lub osoby, u której występujš pierwsze objawy plšsawicy Huntingtona, i która zdaje sobie sprawę, że mogła tę chorobę prze-kazać dzieciom. Skutki choroby genetycznej należy rozważać z kilku punktów widzenia - dotkniętej osoby, rodziny i spolerzeństwa. Ten ostatni aspekt jest istotny dla optymalizacji wykorzystanxa dostępnych œrodków na ochronę zdrowia oraz dla oeeny skutków wprowadzenia mutagenów do œrodowiska życia i pracy. Pr&by liezbowej oeeny skutk&w chorób genetycznych podejmowane były pod tym kštem przez UNSCEAR i Międzynarodowš Iiomisję Ochrony przed Promieniowaniem (International Commission on Radiological ProtectionICRP). Pojęcxa opracowane przez te komisje sš pomocne w analizie obcišżeń genetycznych. ICRP posługuje się przede wszystkim wskaŸnikiem szko ĆD dliwoœci (index of harm), który można opierać na œmiertelnoœci, „ężkoœei uszkodzeń itp. Pewnš miarę tych wszystkich czynników stanowi strata czasu pracy w odniesieniu do normalnego pełnego zatrudnieńia i wyrażona jako liczba lat roboczych na rok i na 1000 zatrudnionych. Stosujšc ten wskaŸnik, można oceniać skutki niektórych spraw genetycznych, np. poronień samoistnych. Znajšc liczbę i wiek zatrudńionych kobiet, częstoœć poronień samoistnych w poszezególnych grupach wieku oraz przeciętny czas niezdolnoœci do pracy (wszystkie dane dostępne ze statystyk służby zdrowia i zatrudnienia), można obliczyć ten wskaŸnik, wiedzšc, że 50% poronień wišże się z aberracjami chromosomalnymż. W polskim systemie opieki lekarskżej należy doliczyć jej koszty. To samo podejœcie, tj. wskaŸnik straty czasu pracy plus koszty opieki lekarskiej, można zastosować do chorób genetycznych, ujawniajšcych œię w póŸniejszym okresie życia (w wieku produkcyjnym). WskaŸnik ten można również odnieœć do ehorób występujšeych we wezesnym okresie życia i prowadzšcych do œmierci w wieku dziecięcym lub do ciężkiego upoœledzenia umysłowego i fizycznego, które uniemożliwia pracę. Innym podejœciem do oceny wielkoœci obcišżeń genetycznych jest analiza odsetka dzieci hospitalizowanch z przyczyn genetycznych i niegenetycznyeh, z uwzględnieniem długoœci przeciętnego czasu pobyt w szpitalu, liczby ponownych hospitalizacji i przeciętnych kosztów leeenia. Pxeglšd danych piœmiennictwa wskazuje, że im wyżœzy jest standard życia danego kraju i im lepsza opieka lekarska, tym wyżœzy jest odsetek dzieci hospitalizowanych z powodu chorób genetycznych. Może się on wahać od 34o/a do 75%, zależnie od kraju, w którym prowadzono badania. Należy zastrzec, że dostępne dane dotyczš stosunkowo wysoko rozwiniętych krajów. Przeciętny czas hospitalizacji paejentów genetycznych jest 1,5 razy dłuższy niż niegenetycznych. Liczba ponownych hospitalizacji z powodu tej samej choroby wynosi przeciętnie 5,3 w porównaniu z 1,3 dla chorych ńiegenetycznych. W Polsce (dane I. Sztachelskiej i H. Wiórowej) odsetek dzieci hospitalizowanych z powodu wad wrodzonych znacznie wzrósł v 1971 r. w porównaniu z 1963 r., zwłaszeza w starszych grupach wiekowych. Wskazuje to na to, że większa liczba chorych genetycznie przeżywa dłuższe okresy. T a b e 1 a 4. Umieralnoć z powodu niektórych wybranych grup chorób genetycznych w cišgu pierwszych 5 lat życia (obliczana na 1000 dzieci). %V nawiasach podano, ile razy wzrasta ryzyko zgonu w tym okresie w porównaniu z całš populacjš (wg UNSCEAR, 1982, na podstawie danych różnych autorów) Choroby 1 rok życia 2 lata 3 lata 4 lata 5 lat Wszystkie uro- dzenia żywe (zdro- wi i chorzy gene- tycznie) 23,6 1,8 Choroby dominu- jšce 98,0(4)() 19,4(11)() Choroby recesyw- ne 98,5(4)() 35,0(19)() Wady wrodzone 130,0(5)() 11,2(6)() 1,0 0,7 0,6 4,2 (4)() 4,7 (7)() 32,6 (33)() 27,0 (39)() 13,1 (22)() 5,6 (sX) 3,0 (4)() 3,3 (5)() Powyższe dane charakteryzujš przede wszystkim obcišżenie sp4łeczne. Z punktu widzenia dotkniętej nsoby i jej rodziny istotne maczenie ma upoœledzenie sprawnoœci życiowej. Można je próbować mierzye stopniem utraty ?1 zdolnoœci do samodzielnego życia. Może ona wyrażać się wielkoœciš utraty zdolnoœci zarobkowej i produkeyjnej lub wielkoœciš nakładów na opiekękoszty pomocy w życiu we własnym domu, koszty hospitaliżacji lub pobytu w domu opieki. W piœmiennictwie dostępne sš nieliczne dane o poszezególnych chorobach genetycznych i trudno jest formułować ogólniejsze wniaski. Całkowicie brak tego typu badań w Polsce. Innym kryterium porównania dla "ciężkoœci" choroby genetycznej może być stopień zwiększenia ryzyka œmierd w porównaniu z przeciętnym w populacji. Tabela 4 przedstawia szacunkowe dane UNSCEAR, dotyczce umieralnoœci dzieci do lat 5 z powodu chorób genetycznych. FORMY I MOLIWOŒCI OPIEKI GENETYCZNEJ Lekarslsa opieka genetyczna wykazuje dwie podstawowe ceehy różnišce jš od tradycyjnej praktyki lekarskiej. Po pierwsze, właœciwe postępowanie genetyczne wymaga zaangażowania dużych wielospecjalistycznych zespołów, z poważnym udziałem specjalnoœci niemedycznych i paramedycznych, jak psychologów, biologów, socjologów i pracowników socjalnyh. Po drugie, w odróżnieniu od tradycyjnego stosunku lekarz - pacjent przedmiotem opieki jest tu grupa ludzi, to jest genetycznie chora osoba i jej rodzina. Stwarza to wiele problemów praktyeznych i etycznych. Coraz lepsze i tańsze sposoby wezesnego wykrywnia chorhb genetycżnych wœród populaeji metodš testów przesiewowych rodżš problemy etyezne i organizacyjne. Zagadnienia te omó - ono szerzej w rozdziale XIV - o poradnictwie genetycznym. Formy opieki genetyrnej mogš być różne ż zależš od konkrtnych możliwoœci udzielenia pomocy. Podstawę stanowi właciwe rozpoznanie choroby x ustalenie toku jej dżiedżiczenia. Każda ehoroba genetyczna, która wišże się z ryzykiem genetycznym, tj. zwiększonym prawdopodobieństwem wystšpienia takiej choroby u następnych dzieci, wymaga rozpznania w możliwie wezesnym okresie życia. Pożwala to bowiexn na udzielenie tej rodzinie porady genetycznej w porę, to jest po urodzeniu pierwszego chrego dziecka. Pomijajšc aspekty humanitarne - tragedię rodziny obcišżonej kilkorgiem chorych dzieci, jest to sprawa o wielkim znaczeniu społecznym, stanowi bowiem podstawę profilaktyki chorób genetycznych. Stšd też najważniejszš zasadš opieki genetycznej jest stwierdzenie, że rozpoznanie przypadku choroby genetycznej jest równoznaczne z identyfikacjš rodziny ryzyka genetycznego. Rodzina ta wymaga porady genetycznej. Nieudzielenie jej lub nieskierowanie do poradni genetycznej należy uważać za błšd w sztuce lekarskiej. Ze społecznego punktu widzenia w grupie chorób, w których wezesne leczenie zaFobiega rozwojowi objawów i które występujš dostatecznie często, uzasadnione jest wprowadzenie diagnostycznych testów przesiewowych obejmujšcych całš populację noworodków lub niemowlšt. Akeja taka musi być powišzana z poradnictwem genetycznym. W przypadku chorób, w których lekarskie, pedagogiczne i psychologiezne postępowanie można rozpoczšć dopiero w wieku szkolnym (np. aberracje chromosomów płciowych - zespół Turnera lub Klinefeltera), działanie w celu wezeœnxejszego ich wykrycia może by dyskutowane. Wezesne rozpoznanie może niepotrzebnie napiętnować rodzinę, która jak się wydaje, nie ponosi istotnego ryzyka genetycznego. Z drugiej strony dzieci z tymi aberracjamż ponoszš większe od przeciętnego ryzyko œmierci w okresie noworodkowym. Próba zmniejszenia tej œmiertelnoœci mogłaby opierać się na badaniu składu chromosomów płciowych przez oznacenie heterochr4matyny płciowej żeńskiej X (ciałka Barra) i męskiej (ciałka Y). yłoby to kosztowne, gdyż albo wymagałoby dużego nakładu pracy, albo użycia bardzo drogich układów do automatycznej analizy brazów mikroskopowych. Można by sobie wyobraziE udostępnienie na zasadzie dobrowolnoœci papulacji w wieku reprodukcyjnym badań na nosicielstwo chorób genetycznych w celu identyfikacjx par ryzyka genetycznego. Można również badać kobiety w cišży w celu wykrycia chorób genetycznych płodu. Podsumowujše, jednš z form opieki genetycznej jest wprowadzenie specjalnych testów przesiewowych lub wykorzystanie badań masowych (np. bilansów zdrowia poszczególnych grup wiekowych dzieci - badania wprowadzone przez Instytut Matki i áziecka) w celu wykrycia w odpowiednim okresie chorób genetycznych. Akcja taka pozwala na identyfikację rodzin ryzyka genetycznego i objęcie ich poradnictwem genetycznym. Jest to opieka retrospektywna, gdyż chodzi o rodziny, w których choroba genetyczna wystšpiła przynajmniej u jednej osoby. Równoległym działaniem jest zaoferowanie porad genetycznych rodzinom osób, u któryh w jakimœ okresie życia lekarz dowolnej specjalnoœci rozpoznał chorobę genetycznš. Zidentyfikowane rodziny mogš zostać objęte prospektywnš piekš. Mog być poinformowane o wielkoœci ryzyka. W przypadku podjęćia decyzji o dalszej prokreacji można tym rodzinom zagwarantować w porę wykonane badania dianostyczne w celu wykrycia okreœlonej choroby. Mogš to byE badania w okresie cišży (patrz rozdział 'XV - Diagnostyka prenatalna), lub też badania w najwczeœniejszym okresie żyeia, w którym można rozpoznać chorobę. Tego typu działanie można by okreœlić jako genetycznš opiekę okołoporodowš. Tego samego typu prospektywnš opiekę można zastosować do wczeœniej zidentyfikowanych grup ryzyka, jak np. znani nosiciele chorób genetycznych lub kobiety rodzšce po 37 roku życia. Opieka okołoporodowa ma zapewnić wczesne rozpoznanie i leczenie chorego dziecka tam, gdzie jest ono możliwe. Obcišżone rodziny mogš również podjšć decyzję przerwania cišży, jeżeli zostanie stwierdzona nieuleczalna genetyczna choroba płodu. Następnym istotnym elementem jest zagwarantowanie możliwoœci leczenia i rehabilitacji fizycznej oraz umysłowej w specjalnych zakładach lub w domu pod kierunkiem fachowego, specjalnie przeszkolonego personelu. Obserwacje zebrane w wielu krajach wskazujš, że rehabilitacja chorych genetycznie przebiega sprawniej w omu niż w zakładach opieki. Rodziny majšce genetycznie chore dzieci wymagajš jednak nie tylko specjalnej opieki lekarskiej i ekonomicznej, ale także porad psychologicznych opartych na opiniach psychologa i socjologa. Rodziny te wymagajš pomocy zarówno w ustawieniu własnej sytuacji życiowej, jak i w wychowaniu zdrowych dzieci. Często bowiem obecnoœE w domu genetycznie chorego dziecka odbija się na rozwoju zdrowego rodzeństwa. POiSUMOWANIE Znajomoœć praw genetycznej regulacji procesów życiowych jest niezbędna do zrozumienia fizjolog i patolgii czlowieka. Lekarz musi nauczyć się "myœleć genetycznie", aby opanować teoretyczne podstawy x zastosowania genetyki w praktyce lekarskiej. Poza tš ogólnš wiedzš każdy lekarz musi umieć identyfikować choroby genetyczne oraz osoby i rodziny ryzyka genetycmego, aby móc skierować chorych i ich rodziny po poradę genetycznš oraz do odpowiedniego specjalisty w celu uœciœlenia lub ustalenia właœciwego rozpoznania oraz postępowania leczniczego. Szczególne znaczenie ma to w praktyce 23 pediatryanej, położniczej, neurologicznej, hematologicznej, dermatologicznej i ortopedycznej. Genetyka medyczna rozwija się szybko i coraz bardziej ulega zróżnicowaniu na takie podspecjalnoœci, jak genetyka kliniczna, poradnictwo genetyczne, cytogenetyka, farmakogenetyka, immunogenetyka, genetyka biochemiczna, genetyka populacyjna, genetyka komórek somatycznych z uwzględnieniem mutagenezy i karcynogenezy, genetyka rozwoju, genetyka matematyczna i genetyka ilaœciowa. Opanowanie całoœci niezbędnej wiedzy przekracza możliwoœci pojedynczej osoby i dlatego prawidłowa medyzna opieka genetyczna wymaga działań wielospecjalistycznego zespołu genetyków i przedstawicieli poszczególnych specjalnoœci klinicznych. Dla zorganizowania właœciwej opieki genetycznej konieczne jest zaangażowanie przedstawicieli specjalnoœci ńiemedycznyeh (biologów, psychologów i socjologów) oraz paramedycznyeh. Do zrozumienia podstaw genetyki potrzebna jest znajomoœć mechanizmów przekazywania cech dziedzicznych i realizacji informacji genetycznej oraz zależnoœ„ tych zjawisk od interakcji z czynnikami œrodowiska. Zazwyczaj o genotypie wnioskuje się na podstawie fenotypu. Należy zdawae sobie sprawę, że wnioskowanie to jest ogranicone i zależne w dużym stopniu od rodzaju i dokładnoœci wybranej metody opisu cech fenotypu. Ghorobami genetycznymi można nazwać odchylenia od stanu prawidłowego, przekazywane jako cecha dziedziczna z pokolenia na pokolenie lb powstałe de novo cechy zwišzane żaburzeniami mechanizmów dziedziczenia. Choroby genetyczne występujš często, stwierdza się je u co dziesištego żywo urodzonego dziecka. 3/o żywo urodzonych wykazuje ciężkie upoœledzenie genetyczne; l% ginie w pierwszym roku życia, a 2% wkracza z tym obcišżeniem w drugi rok życia. Tabele od 1 do 4 podajš wybrane dane o częstoœci chorób genetycznych. Co najmniej połowa poronień samoistmych i ok. 6% œmiertelnoœci okołop-orodůowej wišże się z chorobami genetycznymi. Częstoœć występowania chorób genetycznych nie oddaje obcišżenia poszczególnych chorych osób, ich rodzin i społeczeństwa. Różnorodne próby liczbowych porównań obcišżenia ohorobami genetycznymi dotyczš przede wszystkim skutków socjoekonomicznych. Próbowano okreœlić skrócenie czasu życia, koszty strat produkcyjnych, koszty leczeńia i opieki ora względny wzrost ryzyka œmierci w poszczególnych grupach wiekowych. Brak jest miarodajnych sposobów liczbowego okreœlenia obcišżenia genetycznego. Podstawowš formš opieki genetycznej jest identyfikacja rodzin i grup ryzyka genetycznego w celu objęcia ich działaniami lecznieymi, rehabilitaeyjnymi i profilaktycznymi. Rozpoznanie choroby genetycznej jest równoznaczne z identyfikacjš rodziny ryzyka genetycznego. Rodzina ta powinna być poiformowana o ryzyku i uzyskać kompetentnš poradę genetycznš. Nieudzielenie tej informacji i porady należy uważać za błšd w sztuce lekarskiej. II. Informacja genetczna Krzysztof Boczkowski Genetyka jest naukš o informacji genetycznej, o jej przekazywaniu do pw tomnych komórek oraz o ekspresji, czyli wyrażaniu się tej informacji. Genotypem nazywamy całš genetycznš informację osoby, a więc zspół wszystkich jej genów. Natomiast fenotyp człowieka okreœlamy przez opis jego budowy ciała oraz właœciwoœci biochemicznych, fizjologinych i psychicznych. Również liczba i kształty chromosflmów sš cechami fenotypowymi i ich badanie cytologiczne jest w zasadzie badaniem jednej z cech fenntypu. Chromosomy zawierajš jednak kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), w którym zapisana jest informacja genetyczna, stšd nadmiar chromosomów lub braki w ich składzie, jak również nieprawidłowoœci w ich budowie, wskazujš na nadmiar lub braki w materiale genetycznym. PIZZEKAZYWANIE INFORMACJI GrENETYCZNEJ KOMóRKOM POTOMNYM Wszystkie komórki, z których składa się ustrój wyższy, powstały z jednej komórki, a mianowicie z zygoty, czyli zapłodnionego jaja. Mimo że komórki w ustroju wyższym sš zróżnicowane w rozmaitych kierunkach i wyknnujš rozmaite czynnoœci, wszystkie one pod względem genotypu nie różniš się od komórki macierzystej, czyli zygoty. Cytogenetycznym dowodem genotypowej identyenoœci wszystkich komórek ustroju wyższeg jest ten sam zestaw chromosomów, a więc ten sam kariotyp, niezależnie od tego, czy mamy do czynienia z komórkš tkanki łšcznej, nabłonka czy jakiejkolwiek innej tkanki tego samego organizmu. Jednorodnoœć genotypowa wszystkich komórek implikuje, że w procesie rozmnażania œię komórek muszš wchodzić w grę bardzo precyzyjnie działajšce mechanizmy, które z jednej strony zapewniajš wierne powielanie materiału zawierajšeego informację genetycznš, a z drugiej pozwalajš na dokładny podział tego materiału dla dwóch komórek potomnych. Dzięki osišgnięciom współczesnej bioehem i genetyki wiadomo, że materiałem, w którym zapisana jest informacja o planie budowy i funkcji całego organizmu, jest kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA). Prawie cały DNA znajduje się w chromosomach, w jšdrze komórki, gdzie jego iloœć podwaja się w procesie syntezy, zwanym replikacjš DNA. Proc ten przebiega w okresie międzypodziałflwym jšra komórkowego. Rozdzielenie chromatyd, a więc materiału genetycznego, na dwie komórki potomne zachodzi w wyniku procesu, który jest dostrzegalny dla morfologa 2 i opisywany jako mitoza. W procesi2 tym występuje znaczna kondensacja chromatyny, w wyniku czego możemy obserwować ehromosomy mitotyczne. W procesie mitozy dochodzi do rozszezepienia chromosomów wzdłuż, a póŸniej do rozejœcia się ich do biegunów komórki, gdzie zaczyna się wykształcanie dwóch nowych jšder k:omórkowych. Mitoza jest procesem, który zapewnia dokładny podział materiału genetycznego, w wyniku czego powstajš dwie komórki o identycznym genotypie. Mitoza, którš rnożna badać metodami morfologicznymi, stanowi dla badacza jedynš fazę w cyklu życiowym komórki, w której możliwa jest obserwacja liczby i kształtu chromosomów oraz ewentualnyeh zaburzeń, czyli aberracji chromosomalnych. Z tych względów, głównym materiałem badawezym cytogenetyki sš chromosomy w metafazie, a więc w tym okresie, w którym nie uległy one jeszeze rozszezepieniu i rozejœciu się do komórek potomnych. Liczba chromosomów jest stała dla danego batunku. Korzxórki somatyczne człowieka majš ich 46 - jest to tzv. liczba diploidalna. Natomiast liczba haploidalna, która występuje w dojrzałych komórkach płciowych (gametaeh), vynosi 23. Każdy chromosom ma centromer, znajdujšcy się w tzw. przewężeniu pierwotnym, będšcy wyspecjalizowanym obszarem zwišzanyrn z przemieszezeniem chromosomów potomnych do biegunów wrzeciona kariokinetycznego (podziałowego). Niektóre chromosomy majš również dodatkowe przewężenia wtórne, z których jedno będšce miejscem wytwarzajšcym jšderko - nazywane jest organizatorem jšderka, gdzie wytwarzane s czšsteczki rRNA i formowane podjednostki rybosomów. Centromer Ryc. 1. Ogólny sehemat budowy chromosomu ludzkiego: a - w metafazie chromosom składa się z dwóch chromatyd połšczonych centromerem: b - w czasie anafazy w wyniku prawidłowego podłużnego podziału eentromeru następuje rozejœcie się chromatyd. Po takiej ogólnej eharakterystyce należy opisać bliżej od strony rnorfologieznej tzw. okres spoczynkowy jšdra komórkowego oraz mitozę i chromosomy mitotyczne, gdyż właœnie morfologia mitotycznych chromosomów stanowi podstawowy materiał badawezy cytogenetyki (ryc. 1). I N T Eft FAZA Cykl życiowy komórki możemy podzielić na dwie główne fazy --- interfazę oraz mitozę lub mejozę (ryc. 2). Interfazę nazywano również stanem spoeynku, gdyż nie zachodzš wtedy w komórce widoczne zmiany charakterystyczne dla mitozy i pozostaje ona optycznie ńiezmienrona. Jest to jednak faza bardzo istotna dla życia komórki, gdyż jej cytoplazma różńicuje się wtedy i spełnia swe swoiste funkeje, a jšdro komórkowe przygotowuje się do podziału. W interfazie zachodzi bowiem podwojenie iloci DNA w chromosmach, tzw. replikacja DNA, w czasie której, po rozwinięciu i rożdziale dwóch łańcuchów, podwójna spirala zostaje odtworzona przez dobudowanie komplementarnego łańcucha. Możemy ten proces uwidocznić za pomocš specjalnych metod barwienia, jeœli komórki były hodowane w œrodowisku zawierajšcym bromodezoksyurydynę (BrdU), będšcš analogiem tyminy. Badanie takie wykazuje również wzajemnš wymianę siostrzanych chromatyd, której częstoœć wzrasta w niektórych zespołach chorobowych, zwłaszeza w tych, które predysponujš do procesów nowotworowych. Na przykład w zespole Blooma częstoœć wymiany siostrzanych chromat.yd jest dziesięć razy większa niż normalnie. b \ Interfaza / \ / \ / Profazn to M;toza AnatoZa _ Metnfaza Ryc. 2. Sehematyczne przedstawienie interfazy i mitozy. Pod koniec mitozy w telofazie chromosomy składajš się z pojedynezych chromatyd. W kresie interfazy następuje podwojenie iloœci DNA w chromosomach; na poczštku następnej mitozyw profazie - chromosomy składajš się z dwóch chromatyd. Długoœci poszezególnych odcinków koła nie sš proporejonalne do czasu, gdyż w rzc:czywistoœci okres trwania interfazy jest dłuższy od okresu trwania mitozy (wg Suttona - modyfikacja). Tak więc w interfażie każdy z chromosomów przygotowuje się do majšcej wkrótce nastšpić mitozy. Chemiczny proces - replikacja DNA - zachodzi więc na pewien czas przed ostatecznym podziałem ehromosomu na dwie siostrzane ehromatydy, co odbywa się dopiero w czasie mitozy. Ponieważ w czasie interfazy chromosomy nie sš w stanie skondensowanym, jak w czasie mitozy, sš one niewidoczne lub widoczne bardzo słabo. lPRZEBIEG bllTOZY W przebiegu podziału mitotycznego wyróżniamy eztery fazy: 1) profazę lub fazę przygotowawcš, 2) metafazę, 3) anafazę i 4) telofazę (ryc. 3). Profaxa. Pierwszš zapowiedziš podziału mitotycznego sš zmiany v cytoplazmie. Zanika mianowicie dotychezasowy centrosom, gdyż znajdujšce się w jego obrębie dwie centriole, ktbre dotychezas leżały blisko siebie, zaczynajš oddalać się od siebie i wędrujš na bieguny komórki. Każda z centrioli na bie ? Profaza Metafaza r r,afaza i elofaza Ryc. 3. Schemat przedstawiajšcy podział mitotyczny na przykładzie ezterech chromosomów. Kolejne stadia mitozy: profaza, metafaza, anafaza, telofaza (wg Thompsona i Thompson - modyfikacja). gunach komórki otacza się tzw. centrosferš i w ten sposób powstajš dwa nowe centrosomy. Od każdego z centrosomów rozchodzš się promieniœcie cytoplazmatyczne włókienka, z których w następnej fazie utworzy się wrzeciono kariokinetyczne (podziałowe). Równoczeœnie ze zmianami w cytoplazmie zaczynajš się zmiany w obrębie jšdra, które polegajš na zagęszczaniu się chromatyny jšdrowej. W procesie tym tworzš się nici chromatynowe, które zaczynajš zagęszczać się i wewnštrz jšdra pojawiajš się chromosomy, wyglšdajšce jak splštany klębek nici. Pod koniec profazy wyodrębniajš się poszczególne chromosomy oraz zanika błona jšdrowa. Metafaza. W stadium metafazy chromosomy kurczš się naclal i izlsładajš się v płaszczyŸnie rówńiko - ej komórki, a więc w jednakowej odległoœci od bieg,znów. Taki układ chromosomów nazywamy płytkš równikowš. Równoczeœnie do centromerów chromosomów przyczepiajš się nici wrzeciona kariokinetycznego. Metafazš n.azywamy więc krótki okres, - którym chromosomy znajdujš się w płaszczyŸnie równikowej. áadania mikroskopowe dzielšcycls się komórek człowieka wykazaly, żc stadium metafazy trwa ok. 30 minut. Ponieważ w metafazie chromosomy znajdujš się w stanie konden:;acji, sš one wtedy najłatwiejsze do obserwacji i policzenia, jak również można okreœlić ich charakterystyczny kształt (ryc. 4). Dlatego chromosomy mitotyczne badamy w metafazie; a w celu zaœ zatrzymania ich w tym stadium działamy kolchicynš, która uszltadzajšc wrzeciono kariokinetyczne, uńiemożliwia przejœcie do anafazy. Ogólny schemat budowy chromosomu ludzkiego w stadium metafazy przedstawiono na rycinie I. Chromosom składa się z dwóch chromatyd połšczonych centromerem. Hyc. 4. Mitoza. Chromosomy krwinki białej w stadium metafazy. Widoczne 46 chromosomów. Strzałkami zaznaczone często obserwowane w czasie metafazy wspólne ułożenie obok siebie chromosomów akrocentrycznych majšcych tzw. asocjacje satelitarne. Pow. 1000 X. Anafaza. Chromatydy każdego chromosomu odsuwajš się coraz bardziej od siebie i z chwilš, gdy następuje podłużny podział centromeru, rozdzielajš się całkowicie. Siostrzane chramatydy sš przesuwane przez nici wx'zeciona kariokinetycznego (zaczepione na centromerze) w kierunku przeciwległych centrosomów. Każdy z chromosomów rozszezepił się więc 4statecznie na dwie chromatydy i jedna z nich wędruje do jednego bieguna komórki, druga do drugiego. Dotyrzy to wszystkich chromosomów. W wyniku tego procesu na każdym biegunie znajduje się połowa materiału genetycznego każdego z chromosomów, gdyż na każdym biegunie znajduje się 46 siostrzanych chromatyd. Od tego mnmentu chromatydy siostrzane nazywamy chromosomami siostrzanymi. Telofaza. W telofazie dwie grupy siostrzanych chromosomów zostajš otoczone błonš jšdrwš, zachdzš również zmiany w błonie komórkowej, które prowadzš do podziału cytoplazmy na dwie częœci. Powstajš dwie komórki; każda z nich, podobnie jak komórka macierzysta, zawiera 46 chromosomów, lecz każdy z tych chromosomów w odróżnieniu od komórki maeierzystej składa się nie z dwóch, lecz tylko z jednej chromatydy i - co za tym idzie - zawiera jedynie połowę tej iloœci DNA, którš zawierał chromosom macierzysty. Ponieważ jednak już przed rozpoczęciem mitozy, w wyniku syntezy DNA, nastšpiło podwojenie DNA chromosomalnego, komórki potomne, które wykształcajš się w telofazie, zawierajš iloœć materialu genetycznego równš wartoœci diploidalnej. PRZEBIEG MEJOZY Proces zapłodnienia polega na połšczeniu się materiału genetycznego dwóch gamet - plemnika i jaja; tak więc w zapłodnionym jaju, czyli w zygocie, sumuje się materiał chromosomalny rodziców. Liczba chromosomów w zygocie jest wprawdzie dwukrotnie większa niż w gametach, zachowuje jednak 29 stałš dla gatunku wartoœć rliploidalnš, ponieważ w procesie dojrzewania gamet doszlo do zredukowania liczby chromosomów do połowy. Taka połówkowa wartoœć garnituru chromosomowego nazywa się wartoœciš haploidalnš. Zmniejszenie się do połowy liczby chromosomów i iloœci materiału genetycznego (DNA) zachodzi w komórkach płciowych w czasie dwóch kolejnych sprzężonych ze sobš podziałów, zwanych podżiałami redukcyjnymi albo mejozš. Mejozš nazywamy dwa sprzężone ze sobš podziały komórkowe, w wyniku których powstajš komórki płciowe o zredukowanej do połowy liczbie chromosomów, czyli gamety, oraz dokonuje się wymiana materiału genetycznego między homologicznymi chromosomami. Spermatogeneza i oogncza fomórki płciowe przechodzšce proces mejotyczny nazywajš się u kobietooeytami, a u mężczyzn - spermatocytami. Powstajš one z oogonii i spermatogon na skutek podziałów mitotycznych. Spermabogonie i oogonie rozmnażajš się kilkakrotn„e za pomocš zwykłych podziałów mitotycznych i majš diploidalnš, nie zredukowanš liczbę chromosom„w. Spermatogonie przystępujšce do podziału mejotycznego noszš nazw spermatocytów I rzędu, a oogonie - oocytów I rzędu. W wyniku I podziału mejotycznego ze spermatocytu I rzędu powstajš dwa spermatacyty II rzędu, natomiast z oocytu I rzędu powstaje oocyt II rzędu i pierwsze ciałko kierurikowe. W wyniku I i II podziału mejotycznego powstajš 4 spermatydy (które następnie dojrzewajš i stajš œię plemnikami) albo jedna dojzzała komórka jajowa i 3 ciałka kierunkowe. Różnica między spermatogenezš a oogenezš polega na tym, że w spermatogenezie podział cytoplazxny jest symetryczny i wszystkie spermatydy sš jednakowej wielkoœci, natomiast w wyniku oogenezy powstaje duża komórka jajowa, która pz2ejmuje prawie całš cytoplazmę i zawarte w niej substancje odżywcze, natomiast 3 ciałka kierunkowe sš małe i wkrótce wyrodniejš. Istotny jest również fakt, że oogeneza rozpoczyna się już w czasie życia plodowego, a kończy dopiero w okresie owulacji, tak więc jej czas trwania obejmuje od kilkunastu do kilkudziesięciu lat, natomiast spermatogeneza dokonuje się dopiero w okresie dojrzałoœci płciowej mężczyzny i trwa 74 dni. Dlugotrwały przebieg oogenezy jest, jak się przypuszcza, jednš z zasadniczych przyczyn tłumaczšcych częstsze występowanie aberracji chromosomalnych w komórkach płciowych starych kobiet w porównaniu z komórkami płciowymi starych mężczyzn, co znajduje swój wyraz w częstszym występowaniu ,berracji chromnsomlnych u dzieci staryeh matek. Pierwszy podzia mejotyczny Pierwszy podział mejotyczny zaczyna się od dlugo trwajšcej profazy, która różni się znacznie 4d profazy mitotycznej i dla lepszego jej opisania końieczne jest wyodrębnienie kilku stadiów (ryc. 5). W czasie profazy zachodzi charakterystyczna i istotna dla procesu dziedziczenia wymiana materiau genetycznego pomiędzy homologicznymi chromosomami, zwana crossing-over. W profazie I podziału mejotycznego wyróżniamy następujšce stadia: 1) leptoten, 2) zygoten, 3) pachyten, 4) diploten i 5) diakine2ę. W leptotenie ze zrbu jšdrowego wyróżnicowuja się chromosomy w potaci bardzo Gienich, spltanych nici. 30 W zygotenie chromosomy homologiczne zbliżajš się i układajš obok siebie. Należy przypomnieć tutaj, że w garniturze diploidalnym chromosomy pochodzšce od matki i ojca tworzš pary œciœle odpowxadajšcych sobie chromosomów, zwanych chromosomami homologicznymi. Homologiczne chromosomy, łšczšce się samorzutnie w pary, nazywamy biwalentami. W pachytenie homologiczne chromosomy wybitnie rubiejš i zbliżajš się, przylegajšc do siebie na całej swej długoœci. W diplotenie zaznacza się już wyraŸnie rozszezepienie każdeo z chromosomów homologieznych na dwie chromatydy, tak że każda para chromosomów (biwalent) składa się już z 4 wyraŸnych chromatyd; taki układ nazywamy tetradš. hromatydy stajš œię coraz bardziej wyraŸne i oddalajš się od œiebie, pozostajšc z sobš w łšcznnœci w dwu lub kilku miejscach, gdzie dwie chromatydy homologicznych chromosomów krzyżujš się ze œobš. Te miejsca styków i skrzyżowań nazywamy chiazmami. W chiazmaeh następuje wzajemna wymiana odpowiadajšcych sol7ie odcinków pomiędzy homologicznymi chromosomami, czyli crossing-over (ryc. 6). Po wymianie materiału genetycznego chromosomy homologiczne nie sš już jednoznacznie chromosomami matezynymi lub ojcowskimi, gdyż każdy zawiera geny zarówno ojcowskie, jak i matezyne. Ostatńie stadium profazy mejotyeznej stanowi diakineza. W diakinezie chromoœomy stajš się jeszeze krótsze i przygotowujš œię do metafazy I podziału dojrzewania (ryc. 7). W metafazie tetrady układajš się w œrodku wrzeciona kariakinetycznego, ktbrego nici przyGzepiajš się do centromerów każdego z chromosomów. W odróżnieniu d metafazy mitotycznej podezas metafazy mejotycznej nie dochodzi do rozszezepienia chromosomów na chromatydy, lecz chromoomy rozehodzš się w całoœci. Spoœród każdej pary homologicznych chromosomów jeden chromosom wędruje do jednego bieguna, drugi zaœ do przeciwległego bieguna, przy czym wybór biegunów przez poœzezególne chromosomy dokonuje się losowo. W anafaie na każdym biegunie komórki grupujš się chromosomy, z których jedne majš centromery pochodzšce od matki, inne zaœ - od ojca. W telofazie po skońezonej wgdrówce chromosomów zaczynajš się tworzyć jšdra i dżieli się cytoplazma. Powstajš dwie potomne komórki o zredukowanej liczbie chromosomów. W proeesie spermatogenezy powstajš dwa spermatocyty II rzędu, w oogenezie jeden oocyt II rzędu i jedno ciałko kierunkowe. Różnica między podziałem mitotycznym a I podziałem mejotycznym polega na tym, że w wyniku podziału mitotycznego powstajš dwie komórki, które, podobnże jak komórka macierzysta, majš u człowieka 4s chrnmosomów a każdy z nich składa œię z jednej tylko chromatydy. W wyniku I podziału mejotyeznego pnwstajš dwie komórki, każda z nich ma 23 chromosomy, z których każdy składa się z dwóch chromatyd. Istotna różnica genetyczna polega na tym, że w wyniku podziału mitotycrnego pnłowa każdego z chromosomów dzielšcej œię komórki przeszła do komórek potomnych i dzięl;i temu majš one tę samš informację genetycznš co komórka, z której powstały. Natomiast w czasie I podziału mejotycznego nastšpiła wymiana odcinków mżędzy homologicznymi chromosomami, a do potomnych komórek przeszedł w eałoœci losowo jeden z każdej pary homologiczzzych chromosomów. Tak więc dwie nowo powstałe komórki płciowe (np. dwa spermatncyty II rzędu) różniš się pod ,vzględem informacji genetycznej zarówno w stosunku do komórki macietystej, jak i,pomżędzy sob. 31 I podz iał mejotyczny Lptoten Z ygoten Pachyten Diptoten Metafaza Anafaz Tetofaza Ryc. 5 32 II podziat mejotyczny , Metafaza Anafaza Telotazo Ryc. 5. Schemat przedstawiajšcy podział mejotyczny na przykładzie 4 chromosomów: I - pierwszy podział mejotyczny: a - leptoten, zygoten, pachyten, diploten (widoczne crossing-over); b - metafaza, widoczne dwie pary homologicznych chromosomów (dwa biwalenty); anafaza, widoczne losowe rozejœcie się centromerów (chromosomów) pochodzšcych od matki i ojca; II - drugi podział mejotyczny: metafaza, anafaza, telofaza (wg Thompsona i Thompson - modyfikacja). Drugi podział mejotyczny Bezpoœrednio po I podziale mejotycznym, to znaczy bez interfazy i bez syntezy (replikacji) DNA, następuje drugi podział mejotyczny, którego mechanizm i przebieg jest taki sam jak w mitozie. W profazie II podziału mejotycznego chromosomy ujawniajš się jako złożone z dwóch chromatyd. W metafazie chromosomy ustawiajš się w płaszezyŸnie równikowej. a w anafazie chromatydy każdego z chromosomów rozłšczajš się i rozchodzš do przeciwległych biegunów komórki. Po podziale jšdra następuje podział cytoplazmy. 3 - Zarys genetyki 3 W wyniku mejozy otrzymujemy w sperznatogenezie cztery spermatydy, a w oogenezie jedno jajo i trzy ciałka kierunkowe. Dwa podziały mejotyczne sš często nazywane podziałami redukcyjnymi. Po- dział pierwszy redukuje do połowy liczbę chromosomów w komórce, podział drugi redukuje do połowy liczbę chromatyd; oba zmniejszajš iloœć DNA. Genetyczne znaezenie mejozy Podczas mejozy komórki płciowe przekształcajš się w gamety, które majš połowę chromosomów oraz połowę informacji genetycznej komórki somatycznej danego gatunku. Połšczenie się gamet w zygotę daje w wyniku powrót do właœciwej dla danego gatunku liczby chromosomów. Crossing-over zachodzšce w profazie 1 podziału mejotycznego polega na wymianie odcinków pomiędzy homologicznymi chromosomami. W wyniku cros A A a a A A a a A A a aB B b b B B b b B B b b C C c c C C c c C C c c D d D d D d D d D d D d Ryc. 6. Schemat crossing-over: a - pojedyncze crossing-over, b --podwójne crossing-over, c - kilkakrotne crossing-over (wg Suttona). 34 Ryc. 7. Prawidłowy przebieg mejozy. Chromosomy spermatocytu w diakinezie I podziału mejotyczego. Poszczególne homologiczne chromosomy tworzš biwalenty. Widoczne 23 biwalenty. Biwalent płciowy XY (zaznaczony strzałkš) w odróżnieniu od biwalentów autosomalnych wykazuje połšczenie "koniec z końcem". sing-over każdy z chromosomów ma częœć informacji genetyeznej każdego z homologicznych chromosomów, a więc pochodzšcych od ojca i matki. Ponieważ w anafazie I podziału mejotycznego do każdego z biegunów przechodzš centromery (chromosomy) pochodzšce bšdŸ od ojca, bšdŸ od matki, informacja genetyczna komórek potomnych jest mieszaninš informacji genetycznych zawartych pierwotnie w poszczególnych chromosomach pochodzšcych od obojga rodziców. Tak więc zarówno crossing-over, jak i losowe rozejœcie się homologicznych chromosomów do biegunów umożliwia wymieszanie się informacji genetycznej ojca i matki. Powoduje to, że każdy plemnik i każda komórka jajowa sš cdmienne i że żadna nie jest kopiš informacji genetycznej komórki płciowej, z której powstała. Daje to ogromnš zmiennoœć genotypów i powstawanie niepowtarzalnych kombinacji genetycznych w każdej gamecie, a co za tym idzie w zygocie, w następstwie zaœ rozwój osobnika o niepowtarzalnym, właœciwym tylko jemu genotypie. PORbWNANIE MITOZY I MEJOZY Przekazywanie informacji genetycznej komórkom potomnym odbywa się zarówno w czasie mitozy, jak i mejozy. Te dwa procesy różniš się jednak zasadniczo co do funkcji genetycznej, jakš spełniajš. W czasie mitozy komórki potomne otrzymujš identycznš informację genetycznš jak komórka macierzysta, istotš bowiem tego procesu jest powstanie komórek identycznych w stosunku do komórki macierzystej (ryc. 3). W wyniku mejozy powstajš natomiast gamety o zredukowanej do połowy liczbie chromosomów i cztery razy mniejszej iloœci DNA w stosunku do spermatocytów lub oocytów I rzędu. Ich informacja genetyczna jest odmienna od tej, jakš zawierała komórka macierzysta (ryc. 8), i z chwilš połšczenia się z informacjš genetycznš gamety płci odmiennej powstaje całkowicie nowa, niepowtarzalna informacja genetyczna nowego osobnika. 35 5 G2 M AB G, 1 r 6 ab AB 6, ab 62 i 5 Gz M, Mz Ab 6,z Ab 6 A B 0 Ab 6,iz Ab aB 6zii a B 6z a b 6z,i ; aB 6"" c,B Ryc. 8. Schematyczne porównanie podziału mitotycznego i mejotycznego, na przykładzie pary chromosomów nr 6 oraz alleli A, a i B, b. Rekombinacja chromatyd w wyniku utworzenia chiazm w przebiegu pierwszego podziału mejotycznego, zaznaczona dwiema liniami kropkowanymi. V wyniku mitozy powstajš dwie komórki potomne - o identycznym genotypie, w wyniku mejozy - cztery komórki potomne o odmiennych genotypach. G1 - faza pomitotyczna albo przedsyntetyczna, Sfaza syntezy DNA, GQ - faza posyntetyczna albo przedmitotyczna, M - mitoza, M1 - pierwszy podział mejotyczny, M - drugi podział mejotyczny. CHEMICZNY SKŁAD CHIZOMOSOMÓW I IOLA DNA Chromosomy pod względem chemicznym składajš się z dwóch zasadniczych substancji: kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) oraz histonu (białko). Te dwie substancje, występujšce mniej więcej w tej samej iloœci, tworzš ok. 90/o suchej masy chromosomów. Pozostałe 10% to kwas rybonukleinowy (RNA) oraz białka niehistonowe. T a b e 1 a 5. Skład kwasów nukleinowych - RNA i DNA Cytoplazma kwas rybonukleinowy (RNA) Pentoza D-ryboza Pirymidyny cytozyna, uracyl Puryny adenina, guanina Jšdro kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) D-dezoksyryboza cytozyna, tymina 36 ł4 A FPFPF F I I I I I A G T C C II II II II II T C A G G I I I I I PFPFPFP - PF A T T- A T---A C G C CG AGACTC G AGACTC C A G A C T C G A G A T C T G A G C T C T G A G C ł ł T CT GAGC T CT CG T AGACTCGAGACTCG C T CT GA G C T CT GA G C Ryc. 9. a - model DNA zaproponowany przez Watsona i Cricka, skladajšcy się 2 dwóch helis; b - schematyczne przedstawienie tańcucha DNA składajšcego się z dwóch pasm, których zasadniczy szkielet stanowi pentoza (P) oraz fosforan (F), natomiast adenina i tymina oraz cytozyna i guanina leżš pomiędzy tymi pasmami; c - czšsteczka DNA oraz jej replikacja przedstawiona w dolnej częœci ryciny. Z wraca uwagę ułożenie adeniny naprzeciw tyminy oraz guaniny naprzeciw cytozyny. W wyniku replikacji powstajš dwa identyczne tańcuchy DNA; d - schematyczne przedstawienie replikacji DNA. 37 Kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) i kwas rybonukleinowy (RNA) sš złożone z nukleotydów, które w wyniku hydrolizy rozpadajš się na zasadę azotowš (pirymidynę - cytozynę lub uracyl albo purynę) - adeninę lub guaninę, cukier (pentozę) i kwas fosforowy. Nukleotydy sš więc estrami fosforanowymi N-glikozydów zasad azotowych. Stwierdzano występowanie czterech zasad azotowych i dlatego sšdzono dawniej, że cztery nukleotydy tworzš jednš czšsteczkę kwasu nukleinowego. Obecnie wiadomo, że jedna czšsteczka kwasu nukleinowego zawiera wiele nukleotydów, a istnienie sekwencji (kolejnoœci) nukleotydów w łańcuchu DNA stwarza możliwoœć powstania praktycznie nieograniczonej zmiennoœći w budowie DNA. RNA, podobnie jak DNA, zbudowany jest z nukleotydów. Różnica między obu kwasami polega na radzaju pentozy wchodzšcej w skład nukleotydów - w RNA jest to ryboza, a w DNA dezoksyryboza; ponadto w RNA zamiast tyminy występuje uracyl (tab. 5). RNA składa się z jednego łańcucha, natomiast DNA - z dwóch. Watson i Crick (1953) wykazali, że czšsteczka DNA jest zbudowana z dwu łańcuchów polinukleotydowych owiniętych wokół wspólnej osi i tworzšcych podwójnš spiralę. Spirala ta jest utrzymywana wišzaniami wodorowymi pomiędzy zasadami obu pasm. Wišzania te występujš jedynie między adeninš (A) a tyminš (T) oraz guaninš (G) i cytozynš (C) (ryc. 9). Ten swoisty wzór tworzenia się wišzań wodorowych warunkuje komplementarnoœć sekwencji nukleotydów w łańcuchach DNA tworzšcych podwójnš spiralę. Liczne spostrzeżenia i badania doœwiadczalne wykazały, że DNA jest substancjš, w której jest zakodowana informacja genetyczna. DNA występuje prawie wyłšcznie w jšdrze, a iloœć DNA w każdej komórce diploidalnej w obrębie tego samego gatunku jest stała. W komórkach haploidalnych iloœć ta ulega redukcji do połowy. DNA jest obecny w każdym żywym organizmie z wyjštkiem niektórych wirusów (u wirusów tych stwierdza się obecnoœć RNA i w nim zapisana jest informacja genetyczna). DNA jako przenoœnik informacji genetycznej ma dwie zasadnicze funkcje. Po pierwsze w jego budowie zakodowany jest zapis genetyczny okreœlajšcy syntezę specyficznych białek, a po drugie ma on zdolnoœć samopowielania, czyli odtwazzania podczas syntezy swych wiernych kopii, co znajduje odzwierciedlenie w replikacji chromosomów. Zdolnoœć do replikacji, którš ma DNA, jest podstawowš cechš materii ożywionej. Chemiczna replikacja materiału chromosomowego oraz fizyczne rozdzielenie się dwóch chromosomów potomnych stanowiš dwa odrębne procesy. Replikacja dokonuje się w czasie interfazy - w wyniku syntezy DNA, natomiast rozdzielenie się chr4mosomów potomnych zachodzi w czasie podziału komórki. ItEALIZACJA INFOftMACJl GENETYCZNEJ Przez pojęcie informacji genetycznej rozumiemy swoisty zapis cech dżiedzicznych ustroju w budowie chemicznej czšsteczki, która jest podłożem zjawisk dziedzicznoœci. Liczne badania wykaały, że istnieje podstawowy zwišzek pomiędży metabolizmem a dziedzicznoœciš. Swoiste, dziedzicznie przekazywane cechy metabolizmu zależš od białek o właœciwœciach enzymatycznych. Funkcja biologiczna tych białek zależy od swoistej i niepowtarzalnej sekwencji wchodzšcych w ich skład aminokwasów. Zwišzek hemiczny, w którym byłaby "zakodowana" informacja o sekwencji aminokwasów w białkach, byłby więc noœnikiem cech dziedzicznych rganizmu. 38 T a b e 1 a 6. Hod genetyczny. Trójki nukleotydów mRNA odpowiadajšce poszcze- gólnym aminokwasom Litera w pozycji Druga pozycja Trzecia pierwszej U G pozycja U Fen Ser Tyr Cys U Fen Ser Tyr Cys C Leu Ser stop stop A Leu Ser stop Try G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg A Ile Tre Asn Ser U Ile Tre Asn Ser C Ile Tre Liz Arg A Met* Tre Liz Arg G Wal Ala Asp Gli U Wal Aln Asp Gli C Wal Ala Glu Gli A Wal Ala Glu Gli G Skróty aminokwasów: Ala - alanina Glu - kwas glutaminowy Arg - arginina Gli - glicyna Asn - asparagina His - histydyna Asp - kwas asparaginowy Ile - izoleucyna Cys - cysteina Leu - leucyna Fen - fenyloalanina Lys - lizyna Gln - glutamina Met - metionina Pro - prolina Ser - seryna Thr - treonina Try - tryptofan Tyr - tyrozyna Wal - walina stop - przerwanie syntezy łańcucha *AUG - rozpoczęcie syntezy Skrbty nukleotydów zawierajšcych: A - adeninę, C - cytozynę, G - guaninę, Uuracyl. Badania doœwiadczalne wykazały, że funkcję takš spełnia właœnie DNA. Cztery rodzaje nukleotydów stanowiš znaki kodu genetycznego. Trzy przylegajšce do siebie nukleotydy tworzš podstawowš jednostkę kodu - tzw. kodon, którego informacja przekazana na kodon mRNA (tab. 6) powoduje włšczenie okreœlonego aminokwasu w okreœlone miejsee łańcucha polipeptydowego. Wiele aminokwasów kodowanych jest przez więcej niż jeden kodon. Okre= œlamy to niezbyt fortunnie, mówišc, że kod genetyczny jest "zdegenerowany". Tak na przykład fenyloalanina kodowana jest zarówno przez UUU, jak i przez UUC, a kodonami dla seryny sš UCU, UCC, UCA, UCG, AGU i AGC. Istniejšce obecnie dane wskazujš, że kiedy dwa pierwsze nukleotydy sš identyczne, a trzecim jest uracyl lub cytozyna, to w obydwu przypadkach kodowany jest ten sam aminokwas. Często również adenina i guanina mogš być tak samo zamienione. Zjawisko.,degeneracji" nie ogranicza się jednak tylko do równoważnoœci nukleotydów występujšcych na trzecim miejscu. Wydaje się np., że leucyna może być kodowana zarówno przez UUA i UUG, jak i przez CUU, CUC, CUA i CUG. "Degeneracja" kodu, a zwłaszcza wystgpujšca często na trzecim miejscu równoważnoœć cytozyny i uracylu oraz guaniny i adeniny, pozwala zrozumieć fakt, że różna częstoœć ich występowania, stwierdzana u odmiennych orga 39 nizmów, nie powoduje większych zmian w składzie aminokwasowym białek. Z kolei zaœ analiza swoistych białek nie wykazała korelacji między składem aminokwasów a miejscem danego organizmu na drabinie ewolucyjnej. Funkeję przenoœnika informacji genetycznej spełnia tzw. informacyjny kwas rybonukleinowy, syntetyzowany na matrycy DNA i dzięki temu komplementarny w składzie zasad do transkrybowanej nici DNA. Informacyjny kwas rybonukleinowy, zwany również matrycowym RNA (ang.: messenger - posłańcowy RNA - mRNA), przenosi więc informację genetycznš z DNA jšdra komórkowego do cytoplazmy (ryc. 10). Ryc. 10. Schematyczne przedstawienie transkrypcji (przepisania) informacji genetycznej na nić mRNA, a następnie translacji (przetłumaczenia) jej na sekwencję aminokwasów w procesie tworzenia białka. Poza mRNA w syntezie biorš udział dwie inne frakcje kwasu rybonukleinowego : przenoœnikowy (ang. : transfer RNA - tRNA) oraz rybosomalny RNA (rRNA). Gdy zaczyna się aktywacja genu, wówczas dwa łańcuchy DNA rozdzielajš się. Jeden z nich służy jako matryca, na której zaczyna syntetyzować się nić mRNA, która jest komplementarna (dopełniajšca) w stosunku do przepisywanej nici DNA. Informacja strukturalna zawarta w DNA zostaje przepisana na nić mRNA; nazywamy to transkrypcjš (ryc. 10). Następnie z jšdra komórki mRNA przechodzi do cytoplazmy, gdzie łšczy się z rybosomami, tworzšc tzw. polisomy, które sš miejscem syntezy białka. W cytoplazmie znajdujš się wolne aminokwasy; stwierdzono istnienie 20 różnych aminokwasów. Aminokwasy ulegajš aktywacji i tworzš przejœciowy zwišzek z przenoœnikowym RNA (tRNA). Rola tRNA polega na zwišzaniu okreœlonego wolnego aminokwasu (stšd tyle rodzajów tRNA, ile rodzajów aminokwasów w białkach) i przeniesieniu tego aminokwasu na odpowiednie miejsce na matrycy mRNA - przy czym odbywa się to od odcinka 5' do odcinka 3' (okreœlanych tak zależnie od tego, czy reszta kwasu fosforowego w nukleotydach jest zwišzana z pentozš w pozycji C5 czy C3). Nazywamy to translacjš, tzn. przekładem informacji genetycznej z sekwencji zasad purynowych i pirymidynowych na sekwencję aminokwasów. Ułożone obok siebie ů'w odpowiedniej sekwencji aminokwasy łšczš się między sobš, dajšc w wyniku ezšsteczkę speeyficznego białka, w którym sekwencja aminokwasów jest okreœlona przez mRNA, a poœrednio przez DNA jšdra komórkowego (ryc. 11). Przeważajšca większoœć genów składa się z segmentów kodujšcych okreœlone aminokwasy - nazywanych egzonami, oraz z segmentów nie kodujšcych aminokwasów - nazywanych sekwencjami interweniujšcymi lub intronami (INT). Funkcja intronów nie jest jeszcze poznana. Pierwotny mRNA, podobie jak DNA, zawiera introny, jednak przed przejœciem z jšdra do eytoplazmy, mRNA ulega modyfikacji - przez dodanie w miejscu 5 tzw. struktury ,CAP oraz w miejscu 3 reszt kwasu adenilowego (AAAA) (ryc. 12). Egzony 5' 3' NT NT - fny mRNA 5' 3' 'átona jqdrowa CAP AAAA Ryc. 12. Przejœcie mRNA z jšdr CAP AAAA do cytoplazmy i jego modyfikacja (wg Connora i Ferguson'Otuterzny m RNA CAP AAAA -Smitha). O ile regulacja syntezy białek została dobrze pznana u bakterii, u których wyodrębniono geny strukturalne i regulujšce, o tyle u wyższych organizmów proces ten nie jest do tej pory wyjaœniony. Wiadomo jedynie, że geny strukturalne wyznaczajšce budowę polipeptydów tworzšcych okreœlone białko sš zazwyczaj zlokalizowane obok siebie, lecz nie jest to regułš. lVfUTACJE Proees replikacji DNA, zapewniajšcy identycznš informację komórkom potomnym, jest zwykle absolutnie dokładny, lecz niekiedy może zdarzyć się błšd - nazywany mutacjš (tab. 7). Mutacja taka jest następnie powtarzana w czasie kolejnych replikacji danego łańcucha DNA. Trzy podstawowe typy mutacji to: mutacja punktowa, insercja (wstawienie), delecja (ubytek). O mutacji punktowej mówimy wówczas, gdy następuje zmiana jednej zasady azotowej na innš zasadę azotowš. W wyniku - mogš nastšpić dwa rodzaj e mutacj i : 1. Mutacja zmiany sensu występuje, gdy jeden kodon oznaczajšcy aminokwas zostanie zamieniony na drugi kodon, również oznaczajšcy jakiœ aminokwas. Mogš tu zachodzić dwie możliwoœci: albo powstały w wyniku mutacji nowy kodon jest synonimowy z kodonem przed mutacjš i wtedy w składzie aminokwasowym polipeptydu nie zajdzie żadna zmiana, albo też kodon powstajšcy w wyniku mutacji oznacza odrębny aminokwas i wtedy w polipeptydzie następuje w okreœlonym miejscu substytucja aminokwasowa. 2. Mutacja typu nonsens, gdy kodon sensowny oznaczajšcy jakiœ aminokwas zostanie zamieniony na jeden z kodonów nonsensownych (terminacyjnych)nie oznaczajšcych żadnego aminokwasu, a stanowišcych sygnał zakończenia translacji. Wtedy zamiast polipeptydu kodowanego przez dany gen powstaje krótszy, w zależnoœci od miejsca mutacji, fragment polipeptydu. 42 T a b e 1 a 7. Przykłady mutacji DNA (wg Connora i Ferguson-Smitha) Kodony DNA Aminokwasy Komentarz CAA TTC CGA CGA wal-lys-ala-ala Normalna sekwencja CAA TTT CGA CGA wal-lys-ala-ala Mutacja punktowa bez zamiany aminokwasu CAA CTC CGA CGA wal-glu-ala-ala Mutacja punktowa ze zmianš aminokwasu CAA ATC CGA CGA wal-stop Mutacja punktowa z przedwczesnym stop CAA-TCC GAC GA wal-arg-leu Delecja z zamianš fazy odczytu Natomiast insercja lub delecja dotyczy wstawienia lub ubytku, większej liczby zasad azotowych w DNA danego genu. Powoduje ona mutację zmiany fazy odczytu (ang. frame shift mutation), gdy na skutek delecji lub insercji pary, czy też większej iloœci par nukleotydów (ale nie 3 lub wielokrotnoœci 3), następuje niezgodne z pierwotnš fazš.odczytywanie kodonów w procesie translacji. Natomiast na skutek delecji lub insereji 3 lub wielokrotnoœci 3 par nukleotydów następuje ubytek lub włšczenie nowych aminokwa.sów w powstajšcy łańcuch polipeptydawy. To, czy mutacja genetyczna wystšpi w komórkach płciowych, czy w komórkach somatycznych, ma zasadnicze znaczenie. Jeœli bowiem mutacja genetyczna wystšpi w gamecie, to gdy zmutowany gen jest typu dominujšcego i zwišzany jest z okreœlonš chorobš genetycznš - wywoła on jej powslanie. Mutacja występujšca w gamecie, zarówno dominujšca, jak i recesywna, może być przekazywana również następnym pokoleniom. Natomiast mutacja somatyczna dotyczy jedynie osobnika, u którego powstała i nie jest przekazywana genetycznie. STRUKTURA CHROMATYNY Najważniejszym składnikiem chromatyny jest DNA. Gdy kod genetyczny został rozszyfrowany, naukowcy byli zdziwieni ogromnš iloœciš DNA, jakš zawiera komórka eukariotyczna. Obliczono w przybliżeniu, że iloœć DNA znajdujšcego się w komórce ludzkiej może zakodować od 6 do 7 milionów genów. Dalsze badania wykazały jednak, że obok DNA, którego zapis zostaje ostatecznie przetłumaczony na sekwencję okreœlonych aminokwasów tworzšcych białko - nazywanego DNA unikatowym, istnieje również DNA, który nie ma tej właœciwoœci i którego rola nie jest jeszcze poznana, okreœlany jako DNA powtarzalny. DNA unikatowy tworzy tzw. euchromatynę, która może ulegać całkowitej dekondensacji, gdyż luŸny jej stan jest jednym z warunków koniecznych do procesu transkrypcji. Euchromatyna uwidacznia się jako odcinki słabo zabarwione w czasie badania na pršżki G (oraz mocno zabarwione w czasie badania na pršżki R). Gzęœć DNA to euchromatyna, pazostała częœć tworzy heterochromatynę wykazujšcš silnš barwliwoœć. Heterochromatynę dzielimy na fakultatywnšjest to chromatyna o dużym stopniu kondensacji, która uwidacznia się np. jako chromatyna płciowa X, oraz na konstytucyjnš, która chociaż nie charakteryzuje się tak dużym stopniem kondensacji jak chromatyna fakultatywna, -nie ulega jednak dekondensacji jak euchromatyna. 43 PODSUMOWANIE Zespół wszystkich genów organizmu, czyli pełny zakres jego informacji genetycznej, nazywamy genotypem. Fenotyp natomiast jest to zespół morfologicznych, czynnoœciowych i psychicznych właœciwoœci organizmu. Ponieważ fenotyp jest zdeterminowany genetycznie, na jego podstawie można wnioskować o genotypie osobnika. Brak jednak prostej zależnoœci między genotypem a fenotypem, m.in. dlatego, że wskutek działania mechanizmów regulujšcych tylko mała częœć informacji genetycznej ujawnia się w fenotypie osobnika. Informacja genetyczna zapisana jest w postaci sekwencji nukleotydów czšsteczek DNA wchodzšcych w skład chromosomów. Informaeja zawarta w czšsteczkach DNA zostaje przekazana na kwas rybonukleinowy (mRNA), spełniajšcy funkcję matrycy, na której powstajš łańcuchy polipeptydowe białek. Przekazywanie informacji genetycznej komórkom potomnym odbywa się zarówno w czasie mitozy, jak i mejozy. Te dwa procesy różniš się jednak zasadniczo co do funkcji genetycznej, jakš spełniajš. III. Chromosomy człowieka i ich aberracje Krzysztof Boczkowski Termin "chromosomy" został wprowadzony przez W. Waldeyera w 1888 r w zwišzku z ich zdolnoœciš zabarwiania się barwnikami. Już na przełomie XIX i XX wieku zdobyczš nauk biologicznych było wiele istotnych odkryć dotyczšcych budowy chromosomów oraz ich roli w przekazywaniu cech dziedzicznych. Dopiero jednak dokonany w cišgu ostatnich 30 lat postęp w zakresie technik cytogenetycznych umożliwił łatwe i pewne okreœlenie ich liczby, kształtu i budowy. LICZBA I KSZTAŁT CHROMOSOMÓW W 1956 r. Tijo i Levan, badajšc chromosomy mitotyczne w stadium metafazy, wykazali bezspornie, że liczba chromosomów u człowieka wynosi 46. Badania te, wykonane na komórkach somatycznych, w tym samym roku zostały potwierdzone przez Forda i Hamertona badaniem chromosomów mejotycznych. Każdy gatunek roœlin i zwierzšt ma stałš i charakterystycznš dla siebie liczbę chromosomów, która jest jednakowa u wszystkich normalnych osobników danego gatunku; np. człowiek ma 46, koń 64, a osioł 62 chromosomy. Niekiedy zdarza się, że w częœci komórek osobnika występuje nieprawidłowa liczba chromosomów. Powstaje wtedy mozaika chromosomalna, tzn. stan. w którym w organizmie występujš dwie lub kilka linii komórkowych, z których każda ma innš liczbę chromosomów. W ten sposób w jednym organizmie, w obrębie jednej lub też kilku tkanek, stwierdzamy np. 45, 46 i 47 chromosomów; niekiedy w jednej tkance, np. w skórze, występuje 45 chromosomów, a w innej, np. we krwi, 47 chromosomów. KSZTAŁT CHROMOS OMbW Ogólny schemat budowy chromosomu ludzkiego przedstawia rycina 13. Kształt chromosomu okreœla się zwykle przez podanie, w jakiej pozycji znajduje się centromer, który dzieli chromatydy na dwa odcinki, zwane ramionami. Odcinki te w zależnoœci od ich długoœci naz,ywa się ramionami krótkimi albo długimi. Tak więc zarówno ramiona krótkie, jak i długie składajš się z leżšcych naprzeciw siebie odcin.ków obu chromatyd. Chromosom, w którym centromer znajduje się w polożeniu œrodkowym, nazywa się metacentrycznym, jeżeli natomiast centromer znajduje się nie w œrodku, lecz bl:sko nieg#. to chromosom taki nazywamy chromosomem submetacentrycznym (ryc. 13). Chromosom z centromerem położonym blisko końca nazywamy akrocentrycznym, 45 Ramiona Ramiona Ryc. 13. Różne kształty chromokrótkie krótkie somów: metacentryczny, submetacentryczny, akrocentryczny. Strzałka przerywana wskazuje pozycję centromeru. Ramiona Ramiona dTugie dTugie Metacentryczny Submeta - Akrocentryczny centryczny jeżeli natomiast centromer znajduje się na samym końcu chromosomu, nazywamy go telocentrycznym. Wœród chromosomów człowieka można wyróżnić kształty metacentryczne, submetacentryczne i akrocentryczne, natomiast w prawidłowym garniturze ehromosomalnym człowieka brak jest chromosomów telocentrycznych. Pozycja centromeru w chromosomie może być wyrażona jako wartoœć liczbowa, którš stanowi stosunek (czyli iloraz) długoœci ramion długich do krótkich. Stosunek ten jest większy od 1 w chromosomach akrocentrycznych i submetacentrycznych, natomiast w chromosomach metacentrycznych będzie on wynosił 1. Długoœć chromosomu wyrażamy jako odsetek łšcznej długoœci wszystkich chromosomów garnituru haploidalnego z chromosomem X. Na końcach ramion krótkich chromosomów akrocentrycznych mogš występować tzw. satelity. Satelity sš małymi fragmentami chromosomu, oddzielonymi od reszty przez nie barwišcy aię odcinek, który nazywa się przewężeniem wtórnym. PRAWIDŁOWY KARIOTYP CZŁOWIEKA Chromosomy człowieka klasyfikujemy zgodnie z zasadami opracowanymi przez międzynarodowe konferencje - w Denver w 1960 r., w Londynie w 1963 r., w Chicago w 1966 r., w Paryżu w 1971 r. oraz Sztokholmie w 1977 r. Konferencje te zostały zwołane w celu opracowania zasad klasyfikacji chromosomów. Jako kryteria przyjęto względnš wielkoœć chromosomów w stosunku do innych chromosomów z tej samej komórki oraz ich kształt zależny od położenia centromeru. Poszczególne pary autosomów (chromosomów somatycznych) oznaczono numerami od 1 do 22 i podzielono na 7 grup - od A do G (ryc. 14). Grupa A (nr 1 - 3) : duże, prawie metacentryczne. Grupa B (nr 4 - 5) : duże, submetacentryczne. Grupa C (nr 6 - 12): œredniej wielkoœci, submetacentryezne. Grupa D (nr 13 - 15): œredniej wielknœci, akrocentryczne. Grupa E (nr 16 - 18): œredniej wielkoœci, prawie metacentryczne (nr 16) oraz małe submetacentryczne (nr 17 - 18). Grupa F (nr 19 - 20): małe, prawie metacentryczne. Grupa G (nr 21 - 22): małe, akrocentryczne. Wszystkie wymienione powyżej chromosomy, oznaczone liczbami arabskimi, nazywamy autosomami. Chromosomy płciowe oznaczono symbolami X i Y. 4B Grupa A. Chromosomy nr I - 3. Trzy pary tej grupy sš łatwe do odróżnienia.. Para 1 jest największš parš w garniturze chromosomalnym. Ma ońa często wtórnF, przewężenie w okolicy centromeru. Para pierwsza jest prawie metacentryczna. Para 2 bardziej submetacentryczna, natomiast para 3, podobnie jak para 1, równieżprawie metacentryczna. Grupa B. Chromosomy nr 4 - 5. Dwie pary dajš się łatwo odróżniE od pozostałych chromosomćw na podstawie swej wielkoœci oraz charakterystycznego położenia submetacentrycznego. Jednak odróżnienie tych dwóch par od siebie jest w większoœci komórek praktycznie niemożliwe bez użycia metod pršżkowych. Niekiedy spotyka się komórki, w których jedna z par, tzn. 5, jest wyraŸnie mniejsza. Grupa C. Chrog-nosomy nr 6 - 12 oraz chromosom x. Najtrudniejsze do ułożenia w pary i ponumerowania sš chromosomy z grupy C; właœciwe ich ułożenie wymaga zastosowania metod pršżkowych. Na Konferencji Londyńskiej przyjęto, że zależnie od wielkoœc„, cztery najbardziej metacentryczne pary chromosomów w tej grupie powinny mieE numery 6, 7, 8 oraz 11. Na konferencji w Denver przyjęto, że chromosom X jest najbardziej podobny do pary 6. Należy jednak zaznaczyE, że badania autoradiograficzne Bishop i wsp. (1965), jak również obserwacje innych badaczy, wykazały, że wielkoœć ehromosomu X jest bardzo zmienna i niekiedy odpowiada on wielkoœciš parze 6 niekiedy natomiast nawet parze I1. Ogólnie przyjmuje się, że oba chromosomy X sš naj= bardziej metacentryczne w grupie C. Grupa D. Chromosomy nr 13 - 15. Sš to duże akrocentryczne chromosomy. Para 13 jest największa, natomiast para 15 najmniejsza w tej grupie: Chromosomy tej grupy majš satelity na końcu ramion krótkich. Grupa E. Chromosomy nr 16 - I8. Para 16 jest łatwa do odróżnienia na podstawie swojej prawie metacentrycznej budowy. Często stwierdza się duże różnice w wielkoœci homologicznych chromosomów pary 16. 47 Ryc. 14. Kariotyp żeński 46,XX; pršżki G. Yary 17 - 18 sš submetacentryczne i odróżnienie ich od siebie jest możłiwe #prawie wyłšcznie na podstawie metod pršżkowych. Grupa F. Chromosomy nr 19 - 20. Sš to małe, metacentryczne chromosomy. Odróżnienie poszczególnych par jest prawie niemożłiwe bez zastosowania metod . pršżkowych. Grupa G. Chromosomy nr 21 - 22. Sš to małe, akrocentryczne chromosomy. Posiadajš one satełity. Podobnie jak ehromosomy grupy D, chromosomy grupy G w stadium metafazy często leżš obok siebie oraz obok chromosomów grupy D, jak gdyby połšczone satełitami. Chromosomy 21 sš mniejsze niż chromosomy nr 22. Chromosom płciowy Y. Chromosom Y jest małym, akrocentrycznym chromosomem, podobnym do autosombw z grupy 21 - 22. Morfologicznie może on różniE się od chromosomów z grupy 21 - 22 pod względem wielu cech. Jest on zwykle dłuższy niż chromosomy z grupy 21 - 22. W odróżnieniu od chromosomów z grupy 21 - 22 nie ma on satelitów. Jego ramiona krótkie sš zwykle krótsze niż w grupie 21 - 22 i nie majš przewężeń. Jego ramiona długie, zarówno w hodowlach z kolchicynš, jak i bez kolchicyny, wykazujš charakterystyczne ułożenie równoległe, w odróżnieniu od chromosomów z grupy 21 - 22, których ramiona długie sš rozsunięte pod kštem. CzęœE dystalna ramion długich w badaniu pod mikroskopem fluorescencyjnym wykazuje wyraŸnš fluorescencję. Kariogramem nazywamy zestaw (narysowanych lub sfotografowanych) wszystkich chromosomów jednej dowolnie wybranej komórki, uszeregowanych według umownych zasad, np. zależnie od długoœci, polożenia centromeru i innych. Kariogramy wykonane z losowo wybranych komórek mogš różnić się między sobš na skutek istnienia artefaktów (zgubienia chromosomu), mozaicyzmu itp. Z tych względów chcšc okreœlić kariogram występujšcy najczęœciej i typowy dla danego osobnika, należy wykonać zawsze kilka kariogramów. Kariogram typowy i reprezentatywny dla danego osobnika nazywamy kariotypem. W przypadku mozaiki chromosomalnej kariotypem nazywamy dwa lub kilka kariogramów reprezentujšcych typowe populacje komórek jednego osobnika. Kariotyp reprezentuje całoœe obrazu chromosomalnego danego osobnika lub nawet gatuńku. Termin idiogram używa się jedynie do wykresu kariotypu opartego na pomiarach chromosomów z kilku lub dużej liczby komórek. ABERRACJE CHROMOSOMÓW I ICH POWSTAWANIE Zmiany genetyczne w komórce mogš dotyczyć jedynie pojedynczego genu lub też grupy genów (odcinka chromosomu), jak również całego chromosomu lub kilku chromosomów. Anomalie chromosomalne nazywamy zwykle aberracjami chromosomalnymi. Dzielimy je na strukturalne i liczbowe. Do najlepiej poznanych czynników powodujšcych aberraeje chromosomalne należy promieniowanie jonizujšce oraz wiele substancji chemicznych, zwlaszcza tych, które wywierajš również dzialanie cytostatyczne. Punktem wyjœcia w powstaniu aberracji strukturalnych jest żazwyczaj przerwanie ciagloœci jednego lub kilku chromosomów, nazywane również złamaniem chromosomu. Ułamany fragment chromosomu może być wyeliminowany z komórki w czasie jej podziału albo polšczyć się z chromosomem macierzystym czy z innyni. Tak więc w wyniku złamania chromosomu może nastšpić: calkowita utrata ułamanej częœci (delecja), przestawienie odcinków chromo 48 somu (inwersja), przemieszczenie odcinka chromosomu do innego chromosomu (translokacja) i inne. W wyniku działania czynników szkodliwych mogš powstać również inne zmiany strukturalne, jak: pęknięcia chromatyd, widoczne w postaci pustej przestrzeni między dwoma odcinkami chromosomów, połšczenie się siostrzanych chromatyd, chromosom kolisty, chromosom z dwoma centromerami (chromosom dicentryczny), który zawiera dwa centromery w wyniku skrzyżowania się chromatyd itp. Aberracje liczbowe powstajš zwykle w wyniku nie;prawidłowego podziału komórkowego. Występowanie anomal liczbowych i strukturalnych chromosomów prowadzi do powstania nieprawidłowej informacji genetycznej w wyniku niewłaœciwej liczby genów, nieprawidłowego ich ułożenia lub dysproporcji między liczbš poszczególnych genów. ABERRACJE STRUKTURALNE Aberracje strukturalne polegajš na ńieprawidłowej budowie chromosomu. Aberracje liczbowe, podobnie jak aberracje strukturalne, mogš powstać w każdym okresie życia komórki. Jednak największe prawdopodobieństwo ich wystšpienia istnieje w okresie podziału komórki, gdy chromosomy potomne przechodzš do nowo powstajšcych komórek. Bardzo drobne aberracje strukturalne nie sš możliwe do uchwycenia przy obecnej technice badania cytogenetycznego, nawet przy użyciu technik pršżkowych. Poniżej zostanš omówione najczęœciej spotykane aberracje strukturalne. Powstajš one przeważnie w wyniku przerwania cišgłoœci chromosomu, a więc odłamania się odcinka chromosomu. Taki odłamany odcinek może połšczyć się ponownie z tym samym lub innym chromosomem, co powoduje powstanie inwersji, translokacji lub duplikacji. Odłamany odcinek może również zostać całkowicie utracony przez komórkę. Inwersja Jeżeli nastšpi odwrócenie jakiegoœ odcinka chromosomu, tak że geny leżš na nim w porzšdku odwrotnym, niż to było pierwotnie, nazywamy to inwersjš (ryc. 15). Chociaż w takim chromosomie znajduje się ten sam materiał gene F D g C G H F D B C G H F D C G H Ryc. 15. Inwersja (paracentryczna). Podwójne złamanie chromosomu i ponowne złšczenie się odłamanej częœci, lecz w niewłaœciwych miejscaćh, spowodowało powstanie inwersji (w# Thompsona i Thompson). 4 - Zarys genetyki 49 tyczny, działanie genów może być zmienione wskutek żch nowej pozycji (efekt pozycji). Inwersja paracentryczna (acentryczna) powstaje wtedy, gdy dwa punkty inwersji mieszczš się w obrębie jednego ramienia chromosomu. Inwersja perycentryczna (eucentryczna) powstaje wtedy, kiedy dwa punkty inwersji mieszczš się w różnych ramionach chromosomu i odcinek, który uległ inwersji, zawiera centromer. Translokacja Translokacjš nazywamy przemieszczenie się fragmentu chromosomu w inne miejsce tego samego chromosomu lub innego chromosomu, jak również połšczenie się dwóch chromosomów. Tak więc translokacja jest wynikiem delecji częœci chromosomu i połšczenia się ułamanej częœci z tym samym lub z innym chromosomem (ryc. 16) lub przemieszczenia się ż przyczepienia jednego chromosomu do drugiego. Ryc. 16. Translokacja między dwome niehomo)ogicznymi chromosomami. W wyniku jej powstat duży chromosom (zawierajšcy prawie caly materiat genetyczny) oraz bardzo mały chromosom (wg Suttona). Możemy wyróżnić translokacje intrachromosomalne - wewnętrzne oraz translokacje interchromosomalne - przeniesienle odcinka z jednego chromosomu do drugiego (transpozycja), lub też wzajemnš wymianę odcinków między chromosomami (t. wymienna, t. wzajemna). Wymianę odcinków między homologicznymi chromosomami okreœla się jako siostrzanš, a między niehomologicznymi chromosomami - jako zewnętrznš. Siostrzane transpozycje prowadzš do intrachromosomalnych duplikacji w jednym z chromosomów homologicznej pary, a jednoczeœnie do delecji translokowanego odcinka w drugim z nich. Translokacja wzajemna (reciprocal translocation) może być asymetryczna (aneucentryczna) lub symetryczna (eucentryczna). W pierwszym wypadku powstaje jeden chromosom dicentryczny i drugi acentryczny, a w drugim obydwa translokowane chromosomy sš monocentryczne. Translokacje całych ramion polegajš na tym, że całe (lub prawie całe) ramiona chromosomów zostajš przemieszczone Iub wymienione. Na skutek tego procesu jeden chromosom akrocentryczny (A) i drugi chromosom metacentryczny (B ů C) mogš ulec zmianie na jeden nowy chromosom metacentryczny (A ů B) i drugi chromosom telocentryczny (C) lub z dwóch chromosomów metacentrycznych (A ů B i C ů D) mogš powstać dwa inne (A ů C i B ů D). Szczególne wypadki translokacji całych ramion stanowiš: połš 50 czenia centrycme (tzw. translohacje robertsonowshie), dysocjacje i połšczenia tandemowe. Najważniejsze z nich sš połšczenia centryczne, powstajšce w wyniku połšczenia się ramion długich dwóch chromosomów akrocentrycznych, tworzšcych w ten sposbb jeden chromosom metacentryczny lub submetaeentryczny, majšcy najezęœciej złšczone z sobš dwa centromery (chromosom dicentryezny). Drobny fragment, który nie został włšczony do nowo powstałego chromosomu, zawierajšcy satelity obu chromosomów, lecz nie majšcy centromeru - zostaje zwykle utracony przez komórkę w czasie jej podziału. Odwrotny proces, podezas którego dwa chromosomy metaeentryczne (jeden duży, a drugi mały) tworzš - w wyniku translokacji - dwa chromosomy akrocentryczne, nazywamy dysocjacjš. Duplihacja O duplikacji mówimy wówezas, gdy nastšpi translokacja fragmentu jednego chromosomu do drugiego chromosomu homologicznego. Powoduje to w rezultacie duplikację częœci informacji genetycznej, gdyż te same geny występujš dwukrotnie w jednym chromosomie. Istniejš rbwnież inne mechanizmy powstawania duplikacji. Delecja Utratę częœci chromosomu nazywamy delecjš. Ułamany fragment chromosomu zostaje zwykle utracony w czasie podziału kombrkowego, bo jeżeli nie ma eentromeru, to nie przyczepia się do niego w czasie metafazy włókno wrzeciona kariokinetycznego. Tak więc badaniem cytogenetycznym z reguły stwierdzamy jedynie chromosom z delecjš, a nie możemy stwierdziE odłamanego acentrycznego fragmentu (ryc. 17). C D A B Ryc. 17. Delecja terminalna. Odłamany iragment - jako nie majšcy centromeru - został całkowicie utracony przez komórkę. Odcinki niektórych chromosombw wykazujš szezególnš łamliwoœć, np. odcinki chromosomów: 2q13, 6p23, 9q32, 12q13, 20p11 oraz Xq27 (ryc. 18). Objawy kliniczne zwišzane z łamliwoœciš dotyczš jedynie Xq27, gdyż - jak podajš statystyki - do 10o/o mężezyzn przebywajšcych w zakładach dla umysłowo upoœledzonych to chorzy z zespołem łamliwego chromosomu X; spotyka się rbwnież umysłowo upoœledzone kobiety - nosicielki tej aberracji. Natomiast przyeentromerowe pęknięcie ramion długich autosomu nr 2 jest ciekawe z tego względu, że chromosom ten u ludzi powstał z połšczenia dwdeh chromosombw akroeentryeznych występujšcych u małp, jak goryle, szympansy= orangutany. Ryc. 18. Diagram chromosomów ludzkich, z zaznaczonymi miejscami łamliwymi: 2q13, 3p21, 6p23, 7p11, 8q22, 9p21, 9q32, l0q23, llql3, llq#3, 12q13, 16p12, 16q23/24, 20p11 i Xq27, otwarta strzałka obok 16q22 - oznacza miejsce wrażliwe na działanie interferonu, natomiast długa strzałka obok I0q25 - oznacza pęknięcie uwidacz= niajšce się przy zastosowaniu BrdU (Yassarge i Schmidt). 52 #hromosom kolisty W wyniku delecji obu końcowych odcinków chromosomu, nowo powstałe zakończenia chromosomu mogš wzajemnie się połšczyć, co spowoduje powstanie kolistego chromosomu. ftyc. 19. Chromosom kolisty. W wyniku delecji obu końcowych odcinkdw chro# D #, mosomu nowo powstałe zakońezenia chromosomu połšczyły się wzajemnie, co spowodowało powstanie kolistego LG chrcmosomu. Chromosom kolisty może powstać dopiero gdy oba zakończenia chromosomu zostanš odłamane, gdyż tylko wtedy końce chromosomu łšczš się (ryc. 19). Izochromosom Izochromosom powstaje wskutek nieprawidłowego, poprzecznego podziału centromeru chromosomu macierzystego. Tak więc izochromosom składa się tylko PraWidiowy NieprnwidTo#.vy podz ia T cent romeru podz ia1cenfromeru 4 4 Metafoza I I Ir Replikacja inastepna metnbzo Normalne łzoehromosomy chromo5omy Ryc. 20. Powstanie izochromosomów w wyniku nieprawidłowego, poprzecznego podziału centromeru chromosomu macierzystego. 53 albo z ramion krótkich, albo z ramion długich (ryc. 20). Powoduje to w na- stępstwie brak genów zawartych w utraconych ramionach oraz podwójnš liczbę genów ramion, które zostały podwojone. ABERRACJE LICZBOWE Liczba chromosomów w dojrzałych komórkach płciowych, czyli gametach, wynosi u człowieka 23. Jest to liczba haploidalna i oznaczamy jš zwykle literš n. Zespół chromosomów w komórkach somatycznych oraz w komórkach płciowych przystępujšcych do podziału mejotycznego składa się z chromosomów pochodzšcych w połowie od matki, a w połowie od ojca. Ten zespół 46 chromosomów nazywa się diploidalny i oznaczamy go - 2n. Nieprawidłowoœci liczbowe mogš wystšpić w komórkach płciowych w czasie pierwszego i drugiego podziału mejotycznego lub w okresie życia zarodkowego. Wydaje się, że w przeważajšcej większoœci majš one swoje Ÿródło w nierozdzielnoœci (non-disjunction) par chromosomów w czasie mejozy. Aberracje liczbowe dajš w wyniku poliploidalny lub aneuploidalny garnitur chromosomalny. Poliploidia Garnitur chromosomalny z liczbš chromosomów, która jest prostš wielokrotnoœciš tz i większa niż 2#, nazywa się poliploidalnym (69 chromosomówtriploidalny, 92 chromosomy - tetraploidalny itp.). Przyczynš poliploidii sš czynniki uniemożliwiajšce prawidłowy rozwój komórki. Jednym z nich jest np. oziębienie, które powoduje powstawanie komórek z poliploidalnš liczbš chromosomów. Aneuploidia Garnitur chromosomalny okreœlamy jako aneuploidalny, jeżeli liczba chromosomów nie jest prostš wielokrotnoœciš n. Aneuploidię polegajšcš na braku jednego chromosomu w garniturze diploidalnym nazywa się monosomiš. Obecnoœć jednego dodatkowego chromosomu okreœla się jako trisomię. Jeżeli w garniturze diploidalnym występujš dwa dodatkowe homologiczne chromosomy, to taki stan nazywamy tetrasomiš. Obecnoœć dwóch dodatkowych, niehomologicznych chromosomów nazywamy podwójnš trisomiš. Trisomie sš najczęœciej występujšcymi aberracjami chromosomalnymi, gdyż stanowiš one ponad 50o/o aberracji chromosomalnych występujšcych u płodów z poronień samoistnych oraz 67o/o u noworodków. Problem, czemu trisomie powodujš zmiany fenotypowe, może być najlepiej wyjaœniony przez nieprawidłowoœci rozwoju płodowego. Wydaje się, że zasadniczš przyczynš powstawania anomalii nie jest nadmiar okreœlonych genów, lecz ogólne zaburzenia we wzajemnym działaniu genów, gdyż różne trisomie powodujš wiele podobnych podstawowych nieprawidłowoœci w rozwoju płodu. Aneuploidia powstaje w czasie nieprawidłowego podziału komórkowego mitotycznego lub mejotycznego, w wyniku nierozdzielnoœci lub utraty chromosomu w anafazie. O nierozdzielnoœci (non-disjunction) mówimy wówczas, gdy w anafazie mitozy lub mejozy obie chromatydy jednego lub kilku chromosomów nie rozdzielajš się i przechodzš łšcznie do jednego z biegunów. W rezultacie jedna z ko 54 mórek uzyskuje o jeden lub kilka chromosomów więcej, natomiast druga traci je i zwykle ginie. Utrata w anafazie (loss at anaphase) powstaje prawdopodobnie z powodu uszkodzenia wrzeciona kariokinetycznego. Jedna z chromatyd nie nadšża za innymi do bieguna komórkowego i ostatecznie zostaje całkowicie utracona. W rezultacie powstaje komórka, która nie ma jednego z chromosomów. Nieprawidłowoœci chromosomalne - zarówno w wyniku nierozdzielnoœci jak i utraty w anafazie - powstałe w komórkach płciowych mgskich lub żeńskich powodujš, że zygota wykazuje nadmiar lub brak chromosomów; tak więc nieprawidłowoœci te okreœlamy jako monosomie lub trisomie. Jeżeli natomiast nierozdzielnoœć lub utrata w anafazie wystšpiš już po zapłodnieniu komórki jajowej, powstaje tzw. mozaika chromosomalna. Istniejš wtedy w jednym organizmie dwie linie komórkowe lub więcej, z których każda ma innš liczbę chromosomów. W wyniku utraty w anafazie powstaje mozaika z jednš tylko nieprawidłowš liniš komórkowš. Natomiast w wyniku nierozdzielnoœci w okresie zarodkowym powstaje mozaika z dwiema lub więcej nieprawidłowymi liniami komórkowymi. Należy pamigtae o tym, że w przypadku istnienia mozaiki chromosomalnej może np. w tkankach pochodzenia ektodermalnego występować XX PoazioT P#awidTowy XX XX Ryc. 21. a - schematyczne przedstawienie powstania mozaiki 45,X/46,XX w wyniku utraty w anafazie jednego z chromosomów X, w przebiegu mitozy w olsresie zarodkowym; b - schematyczne przedstawienie powstania mozaiki 45,X/46,XY w wyniku utraty w anafazie jednego z chromosomów Y, w przebiegu mitozy w okresie zarodkowym. Ryc. 22. Schematyczne przedstawienie powstania mozaiki 45,X/ /46,XX/47,XXX w wyniku nierozdzielnoœci chromosomów ptcioXX XW X XXX wych w czasie mitozy w okresie zarodkowym. Pierwszy podział prawidlowy, drugi (jednej z koPodziaT mórek) nieprawidłowy (nierozn ieprawidTowy dzielnoœć). 55 inny kariotyp niż w tkankach pochodzenia mezodermalnego, entodermalnego lub mezenchymalnego; w celu uzyskania pełnego rozpoznania należy więc badać komórki tkanek wywodzšcych się z różnych listków zar:dkowych. Jeœli np. zostanie utracony jeden z chromosomów płciowych, to powstaje w ustroju mozaika z jednš nieprawidłowš liniš komórkowš: 45X/46,XX lub 45,X/46,XY (ryc. 21). Natomiast w wyniku nierozdzielnoœci chromosomów płciowych w okresie bruzdkowania w zarodku żeńskim może powstae mozaika X/XXX * lub X/XX/XXX, a w męskim X/XXY *, X/XY#XXY i inne (ryc. 22). ZAPISYWANIE WYNIKÓW BADAl# T CYTOGENETYCZNYCH W zwišzku z koniecznoœciš odpowiedniego i szybkiego przygotowania danych cytogenetycznych do analizy statystycznej przyjęto jednolity system zapisywania wyników badań cytogenetycznych oraz podzielono zarówno ramiona krótkie, jak i długie chromosomów na odcinki oznaczone dwoma cyframi. W przypadku braku jednego z chromosomów płciowych przyjęto zapis 45,X. W przypadku obecnoœci trzech chromosomów X - zapis 47,XXX. W przypadku obecnoœci czterech chromosomów płciowych - zapis 48,XXXX lub 48,XXXY lub 48,XXYY. W przypadku mozaiki przyjęto zapis: 45,X/46,XY (skrótowo zapiszemy jako X/XY lub XO/XY) 46,XX/46,XY (skrótowo zapiszemy jako XX/XY). W przypadku braku u osobnika z dwoma chromosomami X jednego z chromosomów, np. z grupy D, przyjęto zapis: 45,XX,-D (w razie obecnoœci dwóch chromosomów płciowych X - płeć żeńska) lub 45,XY,-D (w razie obecnoœci chromosomów płciowych XY - płeć męska). W razie obecnoœci u osobnika z dwoma chromosomami X dodatkowego chromosomu z grupy D przyjęto zapis 47,XX,-#-á. Jeżeli można z całš pewnoœciš okreœlić, że brakujšcy lub też dodatkowy chr#mosom jest np. nr 13, to przyjmuje się zapis 45,XX,-13 (w razie braku chromosomu) lub zapis 47,XX,#-13 (w wypadku dodatkowego chromosomu). Podobnie u osobnika z chromosomami płciowymi XY zapis będzie wyglšdał 45,XY,-13 lub 47,XY,-ł-13. Zwiększenie długoœci ramion długich jednego z chromosomów nr 1 w kariotypie męskim zawierajšcym 46 chromosomów, zapiszemy jako: 46,XY lq-#-. Natomiast kariotyp zawierajšcy 47 chromosomów, w którym dodatkowy chromosom nr 14 ma zwiększonš długoœć ramion długich, zapiszemy jako: 47,XY,-f- 14q#-. Izochromosom oznaczamy literš i. Ramiona krótkie zaznaczymy literš p, ramiona długie literš q. Chromosom kolisty - literš r. Tak więc obecnoœć izochromosomu ramion krótkich chromosomu X zapiszemy w kariotypie zawierajšcym jeden normalny chromosom X jako 46 X,i(Xp). Natomiast izochromosom ramion długich chromosomu X jako 46,X,i(Xq) lub skrótowo X,i(Xq). Izochromosom dicentryczny ramion długich X zapiszemy jako 46,X,dic i(Xq), natomiast pojedynczy izochromosom ramion długich chromosomu X oznaczamy jako i(Xq). Delecję ramion długich chromosomu X zapiszemy jako 46,XX,de1(Xq) (skrótowo 46,XXq- lub XXq-) nlbo dokładniej 46,XX,de1(Xql3), co oznacza, że delecja wystšpiła w odcinku 13 ramion długich. # Jeżeli mozaika powstała w czasie pierwszego podziału zygoty 56 z œ ', , , , ; 9 z ; z, 1 2 3 4 5 6 z, p , . , , , . .J v v v :3 # 11 12 , , v v , , z ; z ; z ; :, ; #, 13 14 15 16 17 18 ', q , 19 20 21 22 Y Prqżki G i Q # Prqżki R Ryc. 23. Schemat kariotypu z zaznaczeniem poszczególnych odcinków chromosomów,. uwidocznionych metodami pršżkowymi. Ryc. 24. Schemat chromosomu X z duplikacja pra- wie catych ramion dlugich i delecjš prawie całych ramion krótkieh. 11-. q ter q ter-. p 11 Pojedynczy chromosom X z delecjš ramion krótkich oznaezamy jako Xp- , .a pojedynczy chromosom 5 z takš samš delecjš jako 5p-. Delecję ramion długich chromosomu nr 21 zapiszemy jako 46,XY,de1(21q) #(lub skrótowo 46,XY,21q-). Chromosom kolisty X zapiszemy jako 46,X,r(X), natomiast chromosom kolisty w grupie np. D jako 46,XX,r(D). Translokację oznacza się literš t, po niej następuje nawias, w którym sš #zapisane chromosomy objęte translokacjš. Jeżeli jest to translokacja zrównoważona i oba chromosomy sš obecne, to zapiszemy jš: 46,XY,t(4p-;13q-ł-) - w wypadku przemieszczenia się fragmentu ramion krótkich chromosomu 4 do ramion długich chromosomu 13 lub 46,XY,t(4p-f-;13q-) - w wypadku przemieszczenia się fragmentu ramion długich chromosomu 13 do ramion krótkich chromosomu 4. Gdy w wyniku translokacji następuje połšczenie się dwóch chromosomów, tak że powstaje z nich jeden nowy chromosom, stosujemy zapis: 45,XX,-13, -21-f-t(13q;21q). Oznacza to, że w kariotypie tym stwierdza się brak jednego #chromosomu 13 oraz jednego chromosomu 21. W wyniku połšczenia się ich ramionami długimi powstał nowy chromosom, oznaczony jako 13q;21q. Ostateczna liczba chromosomów jest więc 45. Zastosowanie techniki fluorescencyjnej oraz innych metod pršżkowych pozwoliło na uwidocznienie poszczególnych odcinków chromosomów, wykazujš#cych odmiennš barwliwoœć, i dzięki temu umożliwiło dokładnš identyfikację poszczególnych chromosomów oraz ich aberracji strukturalnych. W celu podzielenia zarówno ramion długich, jak i krótkich na poszczególne odcinki, #przyjęto, aby cyfrš 1 oznaczać te odcinki, które sš położone przy centromerze, natomiast dalsze, kolejnymi liczbami - 2, 3 itd. (ryc. 23). Skomplikowane zapisy, które w wyniku stosowania metod pršżkowych umożliwiajš oznaczanie poszczególnych fragmentów chromosomów, przedsta#wiono na przykładzie czterech konkretnych kariotypów, stwierdzonych u czterech pacjentów badanych z powodu zaburzeń płodnoœci: trzech kobiet oraz j ednego mężczyzny. U pierwszej z kobiet, z kariotypem 46,X,dup(X) (qter-.łpll ::qll-#qter), '58 fragment, który uległ duplikacji, jest stosunkowo duży, gdyż obejmuje ramiona długie od ich zakończenia terminalnego do częœci qll (ryc. 24). Jednoczeœnie złamanie i utrata częœci dystalnej ramion krótkich chromosomu X nastšpiła w miejscu pll, a więc prawie cała długoœć ramion krótkich została utracona. Tak więc chromosom z duplikacjš obejmuje całe ramiona długie oraz częœć ramion krótkich aż do miejsca pll, w którym nastšpiło złamanie co zapisujemy, zgodnie z Konferencjš Paryskš (1971) qter--#pll. Z chromosomem tym połšczył się fragment chromosomalny dajšcy duplikację, składajšcy się z częœci ramion długich od zakończenia terminalnego do miejsca qll - co 14 Ryc. 25. Kariotyp z translokacjš chromosomów nr 10 i II (wg Boczkowskiego i Mikkelsen). Ryc. 26. Schemat translokacji chromosomów nr 13 i 14. 59 zapisujemy: qll--łqter. Miejsce złamania i ponownego połšczenia się chromosomów zaznaczamy podwójnym dwukropkiem :.. U drugiej z kobiet, z kariotypem 46,X,dup(X) (qter-łp21: :#2l#qter), fragment, który uległ duplikacji, jest mniejszy, gdyż obejmuje częœć ramion długich od ieh zakończenia terminalnego do częœci q21. Jednoczeœnie złamanie ż utrata częœci dystalnej ramion krótkich chromosomu X nastšpiły w miejscu p21, a więc tylko mniejsza częœć ramion krótkich została utracona. U trzeciej z kobiet stwierdzono kariotyp 46,XX,t(10;11) (q21;q23), który można zapisać również jako: 46,XX,t(10;11) (lOpter-alOq21::llq23-#llqter; Ilpter- j11q23::l0q2l#lOqter). Oznacza to, że pęknięcia nastšpiły w dystalnych odcinkach chromosomów nr 10 i 11, przy czym dystalne fragmenty chromosomów, które uległy oderwaniu, dokonały translokacji naprzemiennej, tzn. z chromosomem nr 10 połšczył się mały fragment chromosomu nr I1, natomiast z chromosomem nr 11 połšczył się fragment chromosomu nr 10 (ryc. 25). U mężczyzny natomiast stwierdziliœmy kariotyp 45,XY,t(13q;14q), który można zapisać również jako: 45,XY,t(13;14) (13qter#cen-łl4qter). Oznacza to, że stwierdzono jedynie 45 chromosomów, gdyż dwa chromosomy akrocentryczne z grupy D, nr 13 i 14, połšczyły się ze sobš w okolicy centromeru, dajšc w wyniku duży, prawie metacentryczny chromosom, zawierajšcy informację genetycznš ramion długich zarówno chromosomu nr 13, jak i chromosomu nr 14 (ryc. 26). Natomiast ramiona krótkie obu chromosomów zostały najprawdopodobniej utracone. Chromosomy, których nie możemy zaklasyfikować do żadnej z grup, ozna= czamy skrótem #n,ar (marker). Dotyczy to również fragmentów chromosomalnych, które majš centromer. Fragmentów chromosomalnych nie majšcych centromeru nie wliczamy dn ogólnej liczby chromosomów i oznaczamy jedynie skrótem ace (acentric). Chromosomy pochodzenia matczynego oznaczamy skrótem n'tat (maternal); natomiast pochodzenia ojcowskiego skrótem pat (paternal). Poniżej jeszcze raz zostanš podane wymienione skróty ace (acentric) acentryczny ż (isochromosome) izochromosom #n.ar (marker) marker r#at(maternal) matczyny pat (paternal) ojcowski p ramię krótkie q ramię długie T (ring) chromosom kolisty t (translocation) translokacja , rozdziela chromosomy lub ich fragmenty w aberracjach strukturalnych# obejmujšcych więcej niż jeden chromosom . złamanie . . złamanie i połšczenie -# lub - przed chromosomem = naddatek lub ubytek liczby chromosomów -#- lub - za chromosomem = naddatek lub ubytek częœci chromosomu Poszczególne techniki pršżkowe oznaczane sš następujšcymi skrótami: Q pršżki Q QF pršżki # - fluorescencja QFQ pršżki Q - fluorescencja -f- mepakryna QFH pršżki (# - fluorescencja -#- Hoechst 33258 G pršżki G 60 #'E' pršżlsi G - trypsyna GTG pršżki G - trypsyna -# Giemsa GAG pršżki G - kwas octowy -# solanka -#- Giemsa C pršżki C #B pršżki C - wodorotlenek baru CHG pršżki C - wodorotlenek baru -# Giemsa R pršżki R RF pršżki R - fluorescencja RFA pršżki R - fluorescencja #- oranż akrydyny RH pršżki R - podgrzewanie ftHG pršżki R - podgrzewanie #- Giemsa RB pršżki R - BrdU RBG pršżki ft - BrdU #-- Giemsa RBA pršżki R - BrdU -j- oranż akrydyny Szczegółowe dane dotyczšce zapisów aberracji chromosomalnych znajdzie Czytelnik w "Cytogenetics and Cell Genetics" tom 21, nr 6, 1978, a nowsze dane zwišzane z metodami pršżkowymi w "Cytogenetics and Cell Genetics" tom 31, nr 1, 1981. METODY BADAl VllA CHROMOSOMÓW Szybki postęp w badaniu chromosomów człowieka był możliwy dzięki udoskonaleniu technik cytogenetycznych, dokonanym w poczštkach lat pięćdziesištych. Szczególne znaczenie miało zastosowanie kolchicyny używanej od dawna w cytogenetyce roœlin, do zatrzymania mitozy w czasie metafazy, oraz użycie płynów hipotanicznych w celu lepszego rozproszenia chromosomów #łytki metafazalnej. Stosujšc te techniki Tijo i Levan w 1956 r. wykazali, że prawi„łowa liczba chromosomów w komórce ludzkiej wynosi 46. W 1970 r. Casperson i wsp. zastosowali do badania chromosomów człowieka technikę fluorescencyjnš, umożliwiajšcš identyfikację poszczególnych chromosomów. Technika ta umożliwiła również wykrycie w jšdrach komórek męskich jasno fluoryzujšcej grudki chromatyny, powstajšcej w wyniku silnej fluorescencji ramion długich chromosomu Y, okreœlonej jako ciałko Y. Od 1971 roku pojawiło się wiele tzw. technik pršżkowych, umożliwiajšcych identyfikację wszystkich chromosomów człowieka przez odpowiednie przygotowanie preparatów, barwionych następnie barwnikiem Giemsy lub innymi barwnikami; metody te nie wymagajš tak drogiej aparatury, jak technika fluorescencyjna. Zastosowanie tych metod umożliwia coraz dokładniejsze mapowanie chromosomów człowieka. Badanie chromosomów jest dokonywane najczęœciej w leukocytach z krwi obwodowej, fibroblastach i komórkach szpiku kostnego. Najłatwiejsze jest badanie chromosomów w szpiku kostnym, gdyż materiał ten nie wymaga zakładania hodowli komórk#wej, ponieważ w szpiku kostnym znajduje się duża liczba komórek w stanie podziału. Jednak pobieranie szpiku jest trudne i bolesne dla pacjenta i nie może być zalecane, szczególnie w przypadkach, w których jest konieczne powtórzenie badania. Badanie garnituru chromosomalnego w komórkach skóry wymaga natomiast założenia kilkutygodniowej hodowli. Z tego powodu najdogodniejszym i najcztœciej stosowanym badaniem jest ho„owla leukocytów z krwi obwodowej. Prawie wszystkie techniki hodowli leukocytów z krwi obwodowej opierajš się na metodzie opublikowanej przez Moorheada i wsp. w 1960 r. Sš to zarówno makrometody, do wykonywania których pobieraxny ok. 5 ml krwi, jak i mikrometody, umożliwiajšee założenie hodowli z iloœci krwi nie przekraczajšcej 0,1 ml. Po hodowli, trwajšcej trzy doby, wykonujemy preparaty, które oglšdamy z zastosowaniem œredniego powiększenia mikroskopu; z chwilš gdy natrafimy na płytkę metafazalnš, w której chromosomy sš odpowiednio rozproszone, liczymy chromosomy w dużym powiększeniu. Jeżeli w komórce chromosomy sš szczególnie dobrze rozproszone, to dokonujemy bardziej szczegółowej ich analizy, bezpoœrednio spod mikroskopu, lub wykonujemy zdjęcie fotograficzne. Analizę rozpoczyna się zwykle od najmniejszych chromosomów. Rozpoczynamy jš od grupy G, następnie dokonuje się analizy grupy F, E, D, a potem grupy B i A. Chromosomy z grupy C, jako najtrudniejsze do zidentyfikowania, pozostawia się na koniec badania. Oprócz metody rutynowej stosuje się barwienie barwnikiem Giemsy odpowiednio przygotowanych preparatów, co pozwala na uwidocznienie wzorów pršżkowych chromosomów, tzw. pršżków G, C i R, lub badanych w mikroskopie fluorescencyjnym pršżków Q. Podstawš barwienia pršżkowego (z wyjštkiem pršżków Q) jest denaturacja niektórych odcinków chromosomów, które w jej wyniku wykazujš odmiennš barwliwoœć niż pozostałe odcinki. PODSUMOWANIE Liczba chromosomów w diploidalnym garniturze człowieka wynosi 46. Najważniejszymi kryteriami klasyfikacji chromosomu sš: długoœć chromosomu w stosunku do długoœci innych chromosomów danej komórki, pozycja centromeru oraz wzór pršżkowy chromosomu. Chromosomy dzielimy na siedem grup, które oznaczamy literami alfabetu od A do G. Poszczególne pary autosomów sš oznaczone od 1 do 22, chromosomy płciowe symbolami X i Y. Aberracje chromosomalne mogš powstaE zarówno w komórkach płciowych (w czasie pierwszego lub drugiego podziału mejotycznego), jak i we wczesnym okresie życia zarodkowego. Momentem, w którym występujš najczęœciej, jest podział komórki, zarówno mejotyczny, jak i mitotyczny. Aberracje chromosomalne możemy podzieliE na liczbowe i strukturalne. Najczęœciej spotykanymi aberracjami strukturalnymi sš: inwersja, delecja, translokacja i duplikacja. Aberracje liczbowe powstajš najczęœciej w wyniku nierozdzielnoœci i charakteryzujš się brakiem jednego z chromosomów lub obecnoœciš dodatkowego chromosomu. Badanie cytogenetyczne wykonujemy u osób, u których podejrzewamy istnienie aberracji chromosomalnej. Wykonywanie ich natomiast we wszystkich jednostkach chorobowych uwarunkowanych genetycznie jest niecelowe, gdyż przeważajšca większoœć z nich jest spowodowana mutacjš genu, a w zwišzku z tym niewykrywalna badaniem cytogenetycznym. IV. Aberracje chromosomów p#ciowych Krzysztof Boczko#ski W celu powišzania aberracji chromosomalnych z patogenezš zespołów chorobowych, w których zostały one stwierdzone, można posługiwać się dwiema: metodami. Pierwsza z nich polega na zgrupowaniu chorych z pewnym okreœlonym zespołem klinicznym i wykonaniu u nich badań cytogenetycznych; następnie szukaniu powišzań między typami aberracji chromosomalnych, które# udało się stwierdzić, a różnymi formami klinicznymi danego zespołu. Druga metoda polega na zgrupowaniu wszystkich osób, u których stwierdzono okreœlonš anomalię chromosomalnš (np. kariotyp 45,X), w celu przeanalizowania u nich pewnych okreœlonych parametrów; pozwala to zrozumieć znaczenieokreœlonej aberracji chromosomalnej dla rozwoju płciowego, zahamowania wzrostu itp. W niniejszym rozdziale został wybrany pierwszy sposób opisu materiału klinicznego i cytogenetycznego. Wydaje się to celowe dlatego, że lekarz jest z natury rzeczy lepiej zorientowany w zagadnieniach klinicznych niż cytogenetycznych i w zwišzku z tym bardziej dogodne jest dla niego grupowanieů materiału według cech klinicznych. Ponadto dla klinicysty ważne jest stwierdzenie, jaki typ aberracji chromosomalnej charakteryzuje dany zespół chorobowy. Najpierw opisane zostanš zespoły zwišzane z obecnoœciš dodatkowego chromosomu płciowego, a więc: zespół Klinefeltera, mężczyini XYY oraz kobiety XXX, a następnie osoby, u których stwierdza się brak drugiego chromosomu płciowego we wszystkich lub w częœci komórek, a więc kobiety z zespołem Turnera. Aberracje strukturalne chromosomu X nie zostały wyodrębnione jako zespół chorobowy, gdyż nie tworzš one takiego zespołu, a występujš zarówno u kobiet z zespołem Turnera. jak i niekiedy u pacjentek z czystš dysgenezjš go= nad oraz u pacjentek badanych z powodu bezpłodnoœci lub zaburzeń płodnoœci. Najczęœciej stwierdzane mozaiki chromosomów płciowych to: 45,X/46,XX; 46,XY/47,XXY; 45,X/46,XY. Pierwsza z tych mozaik została omówiona w zespole Turnera, a druga w zespole Klinefeltera. Natomiast mozaika 45,X/46,XY występuje najczęœciej w zespole mieszanej dysgenezji gonad oraz w obojnactwie męskim, chociaż opisano również przypadki normalnie zbudowanych,. choć bezpłodnych, mężczyzn, u których nieznaczny procent badanych komórek wykazywał komponent 45,X. Większoœć przypadków obojnactwa prawdziwego oraz żeńskiego lub męskiego nie jest zwišzana z aberracjami chromosomów i dlatego stwierdza się u nich najczęœciej prawidłowy kariotyp: żeński - w obojnactwie żeńskim oraz# prawdziwym, a męski - w obojnactwie męskim. 63: ^GENETYCZNA DETEIf.MINACJA PŁCI =#zynnik męski jest decydujšcy zarówno w determinacji, jak i w różńicowaniu płci u człowieka i u innych ssaków. Płeć zostaje zdeterminowana w momencie żapłodnienia i zależy od tego, jaki plemnik wniknšł do komórki jajowej: czy był to plemnik z chromosomem Y - determinujšcy płeć w kierunku męskim, czy z chromosomem X - determinujšcy płeć w kierunku żeńskim. Decydujšce znaczenie chromosomu Y w męskiej determinacji płci zostało udowodnione w 1959 r. przez Jacobs i Stronga oraz Forda i wsp. na podstawie #badań cytogenetycznych w zespole Klinefeltera. Autorzy ci stwierdzili bowiem, że w wypadku kariotypu 47,XXY lub mozaiki 46,XX/47,XXY następuje męski rozwój osobnika. Dalsze badania cytogenetyczne wykazały, że nawet w wypadku kariotypu 48,XXXY lub 49,XXXXY rozwój osobnika następuje w kierunku męskim. Tak więc obecnoœć ehromosomu Y decyduje ůo męskim rozwoju. Antygen H-Y Jqdra pTodowe O S Hormon #- anty-Mlierowski # o# ó P Sf m OS# P#O Wewngtrzne i zewn#trzne m#skie narzqdy pTciowe Komórki podporowe (Sertolego) Komórki œródmiqższowe jqdra (Leydiga) Ryc. 27. Schemat męskiego rozwoju płciowego. Pod wpływem antygenu H-Y wydzielanego przez komórki podporowe, następuje różnicowanie pierwotnych gonad w jšdra. Powstale w wyniku tego działania jšdra płodowe zawierajš komórki podporowe, wydzielajšce hormon anty- Mllerowski oraz komórki œródmišższowe, wydzielajšce testosteron - maskulinizujšcy #rewnętrzne narzšdy płciowe, oraz powstały z testosteronu dihydrotestosteron - maskulinizujšcy zewnętrzne narzšdy płciowe. W latach siedemdziesištych przebadano antygen H-Y. Badania te wykazały, :że antygen H-Y jest odpowiedzialny za różnicowanie pierwotnej gonady w kierunku męskim (ryc. 27). Dalsze badania potwierdziły zwišzek antygenu H-Y z obecnoœciš tkanki jšdrowej. Stwierdzono mianowicie, że u wszystkich osobników, którzy majš jšdra lub gonadę obojnaczš (ovotestżs), można wykryć antygen H-Y, niezależnie od tego, czy badaniem cytogenetycznym stwierdza sig  nich obecnoœć chromosomu Y, czy też nie. Z drugiej strony, u osobników, u których nie wykształciły się jšdra, bardzo rzadko udaje się wykazać antygen H-Y. Natomiast ohecnoœć antygenu H-Y xnożna stwierdzić nawet wtedy, kiedy osobnik, który już nie ma jšder, mial je jednak w pewnym okresie swego życia, np. w przypadkach anorchizmu (tab. 8). Antygen H-Y jest białkiem zwišzanym z błonš komórkowš i wykazujE zdolnoœć wišzania z komórkami somatycznymi - zarówno XY, jak i XX a specyficznym receptorem jest áQ-mikroglobulina. Natomiast komórki płciowt #64 T a b e I a 8. Występowanie anty#enu H-Y ObecnoœE tkanki jšdrowej i antygenu H-Y Normalni mężczyŸni XY Zespół Klinefeltera MężczyŸni XX MężczyŸni z mozaikš XO/XY lub XX/XY Obojnactwo prawdziwe XX Obojnactwo męskie Zespół niewrażliwoœci na androgeny Brak tkanki drowej i obec oœE Brak morfo enez Brak morfo enezy jšdrowej i obec- jšdrowej i brak antygenu H-Y noœE antygenu H-Y antygenu H-Y anorchizm agonadyzm czysta dysgenezja gonad XY (forma H-Y+) normalne kobiety XX, nosicielki autosomalnej recesywnej mutacji dysgenezja gonad XXp- lub Xi(Xq) zespół Turnera XO normalne kobiety XX czysta dysgenezja gonad XX czysta dysgenezja gonad XY (forma H-Y-) zarówno męskie, jak i żeńskie nie majš zdolnoœci wišzania tego antygenu. Dalsze badania potwierdziły przypuszczenia, że gen odpowiedzialny za wytwarzanie antygenu H-Y jest umiejscowiony autosomalnie. Lau i wsp. (1986 r stwierdzili, że locus tego genu znajduje się w chromosomie nr 6. Sugeruje t # że chromosom Y, a œciœlej mówišc częœć proksymalna jego ramion krótkichjest odpowiedzialna jedynie za regulację ekspresji autosomalnego genu antygenu H-Y. Chromosom Y zawiera więc tylko gen regulujšcy dla antygenu H-Y i dlad gyczy to za ó b ma k# m żcz omosomu Y mogš wykazywać ten antygen: ę yzn XX, jak i kobiet z układem chromosomów płciowych 45,X, 45,X,i(Xq) oraz del(Xp) - a więc tych, które nie majš tygen H-ytkeh h k mn Y# W powyższych przypadkach stężenie aniejsze niż u normalnych mężczyzn, co wskazuje, że rozwój pierwotnej gonady jako jšdra jest zwišzany 2 odpowiednim stężeniem antygenu H-Y. Chromosomy płciowe możemy więc podzielić na: 1) euchromatyczny chromosom - X oraz 2) heterochromatyczne chromosomy - Y i X. Euchromatyczny chromosom X występuje zarówno w garniturze chromosomaln m żeńskim jak i męskim. Natomiast występujšcy u osobników żeńskich drugi, heterochromatyczny chromosom X ulega unieczynnieniu i jest widoczn w o staci grudki chromatyny płciowej. Na uwagę zasługuje fakt, że zaró no hete ychromatyczny chromosom X, jak i chromosom Y, wykazujš asynchronię sw ch wzorów pršżkowych, w odróżnieniu od wszystkich pozostałych chromosomów, których czas replikacji DNA jest œciœle okreœlony i wza emnie zs n chronizowany. j yGe 1 b g y w ł eńie w o# aniem pierwotnej gonady w jajnik mogš być u omatycznym chromosomie X lub również w nie ulegajšcych inaktywacji miejscach heterochromatycznego chromosomu X lub i mogš leżeć w którymœ z autosomów albo w kilku autosomach. Nie potrafimy obecnie wyłšczyć żadnej z tych dwóch możli#voœci. Dla dalszego rozwoju jajników oraz pełnej oogenezy konieczny jest u człowieka drugi heodb wa n# tyczny chromosom X. Różnicowanie pierwotnej gonady w jšdro y natomiast pod wpływem chromosomu Y. Chromosom Y zawiera jednak tylko gen kontrolujšcy produkcję antygenu H-Y. Genetyczna determinacja ptci powoduje w warunkach fizjologicznych zróżnicowanie pierwotnej gonady w kierunku męskim lub żeńskim. Dalszy rozwój płciowy wišże się z czynnoœciš hormonalnš płodowych gonad. Jšdra B - Zarys genetyki płodu, dzięki wydzielanym przez siebie substanejom hormonalnym, odgrywajš podstawowš rolę w różnicowaniu płciowym w kierunku męskim. Substaneje hormonalne płodowych jšder powodujš bowiem kolejno zróżnicowanie w kierunku męskim wewnętrznych i zewnętrznych narzšdów płciowyeh, a następnie oœrodków mózgowych, i to zarówno tych, które kierujš wydzielaniem przysadki. jak i tych, z którymi wišże się zachowanie reprodukcyjne i niereprodukcyjne. W razie braku czynników hormonalnych płodowych jšder rozwój zewnętrznych i wewnętrznych narzšdów płciowych odbywa się w kierunku żeńskim, ustala się również żeński typ oœrodków nerwowych podwzgórza, kierujšcych wydzielaniem przysadki, jak również oœrodków zwišzanych z zachowaniem reprodukcyjnym i niereprodukcyjnym. Żeńskie hormony płciowe łożyska oraz jajników płodowych odgrywajš w tych procesach jedynie pomocniczš rolę. U człowieka, podobnie jak u większoœci ssaków, różnicowanie narzšdów płciowych w kierunku męskim odbywa się więc pod wpływem substaneji hormonalnych wytwarzanych przez jšdra płodowe. Natomiast różnicowanie w kierunku żeńskim jest samoistne, tzn. dokonuje się prawie bez wpływu czynników działajšcych z zewnštrz na narzšdy płciowe, jest więc genetycznie zakodowane w tkankach narzšdów płciowych ssaków. CHROMATYNA PŁCIOWA Barr i Bertram w 1949 r. wykryli w jšdrach komórek osobników żeńskich zasadochłonnš grudkę chromatyny, która swojš wielkoœciš i zbitoœciš wyróżnia się wœród innych grudek chromatyny jšdrowej. Grudkę tę nazywamy chromatynš płciowš lub chromatynš płciowš X (niekiedy nazywa się jš również ciałkiem Barra). Grudka taka nie występuje lub prawie nigdy nie występuje w jšdrach komórek męskieh. W niniejszym podręezniku okreœlenia: chromatyna płciowa, chromatyna płciowa X i ciatko Barra, używane sš jako synonimy i okreœlajš chromatynę płciowš, powstałš w wyniku heterochromatyzacji chromosomu X. Natomiast w jšdrach komórek męskieh Pearson i wsp. w 1970 r. stwierdzili istnienie jasno fluoryzujacej grudki. która powstaje w wyniku silnej fluoresceneji częœci dystalnej ramion długich chromosomu Y. Grudkę tę nazwano ciałkiem Y. CHROMATYNA PŁCIO#'PA X Chromatynę płciowš X bada się najezęœciej w rozmazach z nabłonka jamy ustnej lub w leukocytach krwi obwodowej, choć można jš również stwierdzić w komórkach niemal wszystkich innych tkanek organizmu. Dogodnym materiałem do badań chromatyny płciowej noworodków jest owodnia. U normalnej kobiety odsetek komórek w rozmazach z jamy ustnej, w których stwierdza się chromatynę płciowš, wynosi ponad 20o/o. W piœmiennictwie podane sš również inne wartoœci tego odsetka u normalnych kobiet, co tłumaczy się różnicami w technice badań poszezególnych autorów. W patologicznych przypadkach można stwierdzić aberracje w chromatynie płciowej, które mogš być jakoœciowe - mniejsza lub większa niż normalnie grudka chromatyny płciowej albo iloœciowe - obecnoœć dwóeh lub więcej grudek chromatyny płciowej w jednej komórce. Okreœlenie chromatyny płciowej X jest istotnym wstępnym krokiem w badaniu garnituru chromosomalnego (ryc. 28). Jest to najprostsza, ehociaż poœrednia, metoda wykrywania aberracji chromosomu płciowego X. Ryc. 28. Chromatyna płciowa X w jšdrze komórki z nabłonka jamy ustnej (zazna- czona strzałkš). itariotyp Fenotyp XO ZespóT Turnera 0 XY .ó Normalny mgżczyzna 0 XX Normalna kobieta XYY ZespóT Klineteltera XXX Kobieta XXX Ryc. 29. Zwišzek pomiędzy chromosomem X i chromntynš ptciowš X. Bralc chromatyny płciowej, poza normalnymi osobnikami męskimi z kariotypem 46,XY, stwierdza się w przypadkach aberracji chromosomalnych z następujšcymi kariotypami: 45,X, 47,XYY. Jednš grudkę chromatyny pł„owej stwierdza się nie tylko u osobników płci żeńskiej z kariotypem 46,XX, lecz również w przypadkach z kariotypem 47,XXY, 48,XXYY. Dwie grudki chromatyny płciowej stwierdza się w wypadku kariotypów: 47,XXX, 48,XXXY, 49,XXXYY. Trzy grudki chromatyny płciowej stwierdzono w kariotypach: 48,XXXX, 49,XXXXY; tak więc liczbę grudek w stosunku do liczby chromosomów X można okreœlić wzorem n-I (ryc. 29). Teoria Lyon Obecnoœć chromatyny pł„owej w komórkach żeńskich zwróciła uwagę na jej zwišzek z chromosomami X. Zagadnienie tego zwišzku zostało wyjaœnione w teorii opracowanej przez Lyon. Zgodnie z hipotezš tej badaczki we wczesnym 67 okresie życia płodowego (ok. 16 dnia) jeden z chromosomów X w komórkach zarodka żeńskiego zostaje zinaktywowany (unieczynniony), staje się heterochromatyczny i dzięki temu widoczny w postaci grudki chromatyny płeiowej X w komórkach w okresie interfazy. Tak więc w normalnym garniturze żeńskim czynny jest tylko jeden z chromosomów X. Jak wiemy, w ustroju żeńskim chromosomy X różniš się między sobš pochodzeniem: jeden z nieh powstał w matezynej, a drugi w ojcowskiej linii komórek rozrodezyeh. 0 0 / D \ 0 0 D 0 0 0 a / b c ftyc. 30. VVyniki badań Lyon i wsp. (1964): a - zgodnie z losowym unieczynnieniem jednego z chromosomów X (w jednych komórkach pochodzenia ojcowskiego - zaznaezone prostokštem, a w innych pochodzenia matezynego - zaznaczone kółkiem) u myszy stwierdza się mozaikę dwóch kolorów sierœci; b, c - w wypadku, gdyby inaktywacja chromosomu X nie istniała lub tylko chromosom X matezyny czy ojcowski uległ inaktywacji, stwierdzałoby się jednolity kolor sierœci (wg Lyon i wsp.modyfikacja). W częœci komórek zarodka losowo ulega unieczynnieniu chromosom poehodzenia matezynego Xmat (maternal), w innych natomiast - chromosom pochodzenia ojcowskiego Xpat (paternal). W ten sposób w ustroju żeńskim powstaje swoista mozaika, złożona z komórek X#'nat i Xpat (ryc. 30). Inaktywacji ta jest prawdopodobnie spowodowana metylacjš DNA. Ostatnio przyjmuje się, że chodzi raczej nie o inaktywację drugiego z chromosomów X, lecz o to, że istniejšcy mechanizm aktywacji umożliwia zawsze tylko aktywację jednego chromnsomu X; stšd wszystkie pozostałe pozostajš nieaktywne, chociaż nie sš inaktywowane. Słusznoœć hipotezy Lyon znalazła potwierdzenie w pracach innych badaczy, a wnioski teoretyczne z niej wynikajšce wyjaœniły wiele niejasnych i spornych problemów; można je streœcić w następujšcych punktach: 1. Każdy unieczynniony chromosom X uwidacznia się w postaei grudki chromatyny płciowej X. U osobników majacych dodatkowe chromosomy X - kariotyp 4?,XXX - stwierdzono istnienie dwóch grudek ehromatyny płciowej. Dalsze badania wykazały, że każdy dodatkowy chromosom X jest widoczny w postaci grudki chromatyny płciowej, np. w przypadkach z kariotypem 49,XXXXY stwierdzono obecnoœć trzech grudek chromatyny płciowej. 2. Ponieważ kobieta ma dwa chromosomy X, a mężezyzna tylko jeden, teoretycznie homozygotyczna kobieta powinna np. wytwarzać dwa razy więcej niż mężezyzna globuliny przeciwhemofilowej i dehydrogenazy glukozo-6-fosfo ranowej, a więc substancji białkowych, których synteza uwarunkowana jest przez geny zawarte w chromosomach X. Fakt, że kobieta nie wytwarza tych substancji dwa razy więcej niż mężczyzna, tłumaczy się, w œwietle hipotezy Lyon, unieczynnieniem jednego z chromosomów X kobiety. 3. U osobników żeńskich majšcych dwie populacje czynnych chromosomów: Xpat (paternal) i X#n.at (maternal) nie ujawniajš się cechy recesywne sprzężone z tym chromosomem, jak hemofilia lub œlepota na barwy. Mogłoby się wydawać, że jeżeli jeden z chromosomów X kobiety ulega unieczynnieniu, to ma ona tylko jeden czynny chromosom X, podobnie jak mężczyzna. Należy jednak pamiętać o bardzo istotnej modyfikacji. Unieczynnieniu ulega losowo jeden z chromosomów X, pochodzšcy od ojca albo od matki, i to w ten sposób, że w jednych komórkach unieczynnienie dotyczy X#n.at, a w innych Xpat. Dlatego w organizmie kobiety tworzy się swoista mozaika czynnych Xmat i Xpat. Możemy teoretycznie przyjšć, że jedna połowa komórek kobiety zawiera czynny chromosom X pochodzšcy od ojca, natomiast druga połowa komórek ma czynny chromosom X pochodzšcy od matki. Badania autoradiograficzne wykazały, że u normalnej kobiety jeden z chromosomów X dokonuje replikacji DNA póŸniej niż inne chromosomy i jest to, jak się okazało, unieczynniony chromosom X, widoczny w kształcie grudki chromatyny płciowej. Badania autoradiograficzne wykazały ponadto, że podobnie póŸny czas syntezy DNA majš dodatkowe chromosomy X, np. w przypadku kariotypu 47,XXX lub 48,XXXY. W delecji chromosomu X stwierdza się niekiedy małš grudkę chromatyny płciowej, natomiast w przypadku istnienia dużego chromosomu X (izochromosom ramion długich X) stwierdza się zwykle dużš grudkę chromatyny płciowej. Ważny zarówno z punktu widzenia genetyki teoretycznej, jak i genetyki medycznej jest problem, czy zawsze chromosomem ulegajšcym inaktywacji, a więc widocznym w okresie interfazy w postaci grudki chromatyny płciowej, jest nieprawidłowy strukturalnie chromosom X. Istotne sš tutaj badania chromatyny płciowej w przypadkach z aberracjami strukturalnymi chromosomu X. Wielu autorów wykazało, że chromatyna płciowa jest większa niż normalnie w przypadkach, w których, oprócz prawidłowego chromosomu X, stwierdza się izochromosom ramion długich chromosomu X. Osoby z tš aberracjš chromosomalnš wykazujš zwykle cechy zespołu Turnera. Lindsten stwierdzil ponadto, że chromatyna płciowa utworzona przez izochromosom ramion długich chromosomu X jest nie tylko większa niż normalnie, ale zawiera również więcej DNA niż chromatyna płciowa utwnrzona przez prawidłowy chromosom X. Powyższe dane prowadzš do wniosku, że unieczynnieniu ulega zwykle nieprawidłowy, nie zaœ prawidłowy chromosom X, co nie jest jednak regułš. Stwierdzono również, że nie cały heterochromatyczny chromosom X ulega inaktywacji. Wykazano bowiem, że w chromosomie tym nie ulega inaktywacji gen odpowiedzialny za wytwarzanie obecnego we krwi antygenu Xg oraz gen odpowiedzialny za produkcje sulfatazy steroidowej. Oba te geny zostały umiejscowione blisko siebie, w częœci dystalnej ramion krótkich chromosomu Xtak więc najprawdopodobniej ndcinek od Xp22.13 do Xp22.3 nie ulega inaktywacj i. CIAi,K0 Y W badaniu chromosomu Y szczególnie istotna okazała się metoda fluorescencyjna. Wykazała ona, po zabarwieniu preparatu mepakrynš, wyjštkowo jasnš fluoresceneję częœci dystalnej ramion długich chromosomu Y, co umożliwia jego identyfikację. Badania te wykazały również, że długoœć fluoryzujšcego od 69 cinka ramion długich jest różna u różnych osobników. Nie stwierdzono, aby było to zwišzane z cechami fenotypowymi. W okresie interfazy chromosom Y widoczny jest w jšdrze komórkowym w postaci małej grudki - wykazujšcej silnš, ostro odgraniczonš fluorescencję - nazywanej ciałkiem Y (ryc. 31). Liczba ciałek Y oraz intensywnoœć ich fluorescencji jest niezależna od czynnoœci jšder lub stężenia wydzielanych androgenów. Ciałko Y stwierdza się w od 30 do 50o/o badanych komórek. Ryc. 31. Ciałko Y (zaznaczone strzałkš) stwierdzone w jšdrze komórki cebulki włosa osoby z kariotypem 46,XY (wg Schwingera i Boczkowskiego). Badanie ciałka Y jest stosowane obecnie jako test przesiewowy (screening test) w poszukiwaniu osobników z chromosomem Y zarówno w prenatalnym, jak i postnatalnym okreœlaniu pł„ oraz w wykrywaniu pacjentek z męskim chromosomem Y. Należy jednak pamiętać o tym, że nawet normalni mężczyŸni z małym chromosomem Y mogš nie wykazywać ciałka Y z powodu delecji heterochromatycznej częœci ramion długich chromosomu Y. Również niektórzy pacjenci z mozaikš 45,X/46,XY nie wykazujš ciałka Y. W porównaniu z badaniem chromatyny X wykrycie ciałka Y jest mniej czasochłonne, a interpretacja badanego materiału jest łatwiejsza. Badanie ciałka Y wymaga jednak mikroskopu fluorescencyjnego i dlatego jest w Polsce rzadko stosowane. Porównanie wyników badań chromatyny X i chromatyny Y prowadzi do wniosku, że wybór jednej z tych metod zależy od celów oraz możliwoœci i techniki pracy danego oœrodka. GENETYCZNA ROLA HETEROCHROMATYNY Przekonanie, że płeć jest okreœlona wplywem heterochromatyny chromosomów płciowyeh na zasadnicze procesy prowadzšce do jej różnicowania, jest starš teoriš genetyki. Interesujšce i nie rozwišzane zagadnienie stanowi problem, w jaki sposób działa heterochromatyna - czy jest to działanie specyficzne, a więc wpływajšce na okreœlony proces zwišzany z determinacjš płci, czy niespecyfiezne, a więc wpływajšce na pewne ogólne procesy, których zmiana prowadzi do zróżnicowania płci w œciœle okreœlonym kierunku. Oczywiœcie, różnica między działaniem specyficznym a niespecyficznym jest płynna. Przeważa poglšd, i wydaje się on bardziej uzasadniony, że działanie to jest niespecyficzne, a więc, że heterochromatyna działa na ogólne procesy rozwojowe we wczesnym okresie płodowym, wpływajšc na procesy wzrostowe komórek, na rytm podziału komórek oraz metabolizm komórkowy. i0 U człowieka przeœledzono wpływ iloœciowy heterochromatyny chromosomów X i Y na wiele cech fenotypowych: szczegółowe badania prowadzono nad poziomem inteligencji, wzorem listewek skórnych opuszek palców oraz nad wzrostem. Polani (1969) stwierdził, że obecnoœć każdego dodatkowego chromosomu X powoduje zmniejszenie ogólnej liczby listewek skórnych o ok. 30, natomiast obecnoœć dodatkowego chromosomu Y tylko o ok. 20 listewek. Wpływ dodatkowych chromosomów płciowych na podwyższenie wzrostu jest niezaprzeczalny, przy czym silniejszy jest wpływ chromosomu Y. Najlepszš ilustracjš dla tego stwierdzenia sš mężczyŸni XYY, których najbardziej charakterystycznš cechš jest wysoki wzrost. ZESPÓŁ KLINEFELTERA Zespół Klinefeltera występuje u osobników męskich i charakteryzuje się niepłodnoœciš, eunuchoidalnymi proporcjami ciała oraz dysgenezjš jšder (ryc. 32). W 1956 r. kilku pracujšcych niezależnie od siebie badaczy wykazało, że w przypadkach zespołu Klinefeltera stwierdza się w komórkach chromatynę Xgla+! Xg#a+? Xg(a-))#Xgla+; Xg;a+) M.F Deuteronopia Ryc. 32. a - Zespół Klinefeltera u pacjenta M. E. (w œrodku) z kariotypem 47,XXY; #obok jego dwaj normalni bracia. U obu braci stwierdzono deuteranopię natomiast w przypadku zespołu Klinefeltera widzenie barw było prawidłowe. Wiek chłopców 14, 12 (M. E.) oraz 8 lat; b - drzewo genealogiczne rodziny M. E. Proband zaznaczony strzałkš. U obu braci probanda autor stwierdził deuteranopię natomiast proband i jego rodzice majš prawidłowe widzenie barw. Ponieważ obaj bracia majš deuteranopię, natomiast u jednego z nich stwierdzono grupę krwi Xg(a-), a u drugiego Xg(a-#), wskazuje to na rekombinację pomiędzy genami grupy krwi Xg oraz widzenia barw. 71 cji oraz wzajemnych odległoœci pomiędzy genami umiejseowionymi w chro- #mosomie X. Pozwoliła ona również na przeprowadzenie analizy, jakiego po- chodzenia - matczynego czy ojcowskiego - jest chromosom X w przypad- ku aberracji chromosomalnych, takich jak 45,X, 45,X/46,X, i(Xq) - izochro- mosom ramion długich X, lub 47,XXY. T a b e I a 9. Pochodzenie dodatkowego chromosomu X w przypadkach z kariotyůpem 47,XXY Grupa Xg Pochodzenie dodatkowego ojca matki 47,XXY chromosomu X matczyne -.# ojcowskie + nie wyjaœnione Badania wykorzystujšce grupę Xg jako znacznik genetyczny, pozwoliły ńa wykazanie pochodzenia chromosomów X w wielu przypadkach zespołu Klinefeltera. Przypadki zespołu Klinefeltera z kariotypem 47 XXY można podzielić na dwie grupy, zależnie od pochodzenia ich chromosomów X: XmatX#n.atY Iub X#n.atXpatY (tab. 9). Obecnoœć dwóch matczynych chromosomów - X#n.atX7n,atY wskazuje na nierozdzielnoœć chromosomów płciowych w czasie oogenezy, natomiast obecnoœć ehromosomu płciowego X ojca - Xnz.atXpatY, wskazuje na defekt w czasie spermatogenezy, gdyż zarówno chromosom X, jak i Y pochodzš od ojca. WIEK RODZICbW Lenz, który zebral dane dotyczšce ponad 100 przypadków zespołu Klinefeltera z pozytywnš chromatynš płciowš, stwierdził, że wœród dzieci matek starszych, zwłaszcza powyżej 40 roku życia, częstoœć zespołu Klinefeltera wynosi aż 14,7#/o. Wykazał on również, że więcej pacjentów, niż można by się tego spodziewać, znajdowało się wœród rodzeństwa młodszego wiekiem. Stwierdzenie starszego wieku matek oraz ojców, jak również faktu, że paůcjenci byli często ostatnimi dziećmi w rodzeństwie, jest zgodne z obserwacjami wielu autorów. Mogš istnieć dwa wytłumaczenia tego stanu rzeczy: 1) wzrastajšca tendencja do nierozdzielnoœci w czasie oogenezy, wraz ze wzrastajšcym wiekiem matek, 2) wzrastajšca tendencja do nierozdzielnoœci w czasie spermatogenezy, wraz ze wzrastajšcym wiekiem ojców. Dane dotyczšce znaczenia wieku ojców sš zbyt skšpe, aby można było wypowiedzieć się na temat jego wpływu na powstanie zespołu Klinefeltera, a tym samym okreœlić, w jakim stopniu powstanie tego zespołu jest spowodowane zaawansowanym wiekiem matek, a w jakim starszym wiekiem ojców. i4 ###czv#N# xx Dzięki badaniom cytogenetycmym wyodrębniono grupę mężczyzn z normalnym kariotypem żeńskim 46,XX. Pomimo żeńskiego kariotypu mężczyŸni ci majš geny determinujšce rozwój pierwotnej gonady w kierunku męskim albo w wyniku translokacji częœci ramion krótkich chromosomu Y do chromosomu X, albo na skutek mutacji genetycznej, która hajczęœciej występuje rodzinnie. Etiologia tych przypadków jest całkowicie różna od etiologii zespołu Klinefeltera, lecz pod względem budowy, stanu narzšdów płciowych i histolog gonad nie różniš się one lub różniš jedynie nieznacznie od zespołu Klinefeltera. Większoœć mężczyzn, u których stwierdzono kariotyp żeński 46,XX, była na podstawie badania klinicznego oraz obrazu histologicznego jšder klasyfikowana do zespołu Klinefeltera. Dopiero po stwierdzeniu żeńskiego kariotypu 46,XX starano się znaleŸć różnice pomiędzy tymi przypadkami a typowymi przypadkami zespołu Klinefeltera. Różnice te sš zbyt małe, aby można było mówić o typowo odmiennym od zespołu Klinefeltera z kariotypem 47,XXY obrazie klinicznym mężczyzn XX (ryc. 35). Również czynnoœć hormonalna tych paejentów jest taka sama, jak w zespole Klinefeltera z kariotypem 47,XXY. Wykrycie mężczyzn z kariotypem żeńskim 46,XX wniosło nowe fakty do badań nad determinacjš i różnicowaniem płci. Nie poznaliœmy jednak w pełni etiologii tej anomalii rozwoju płciowego, czego dowodem może być kilka hipotez dotyczšcych rozwoju fenotypu męskiego u osobników z garniturem chromosomalnym żeńskim 46,XX, a mianowicie: 1. Nie wykryta mozaika z liniš komórkowš majšcš chromosom X. 2. Translokacja częœci lub całego chromosomu Y do innego chromosomu. 3. Utrata chromosomu Y we wczesnym okresie rozwoju zarodka z kariotypem 47,XXY. 4. Wykazywanie defektu chromosomalnego nie jest konieczne do wytłumaezenia patogenezy mężczyzn XX. Powstanie tej anomalii może być wynikiem mutacji genu zwišzanego z różnicowaniem płciowym, a umiejscowionego na chromosomie nr 6, z którym sprzężony jest gen strukturalny kodujšcy antygen H-Y; lub genu kontrolujšcego produkcję antygenu H-Y, który sprzężony jest z chromosomem X. W œwietle opublikowanych ostatnio danych wydaje się, że przyczynš powstania zespołu mężczyzn XX jest, w wielu przypadkach, translokacja częœci terminalnej ramion krótkich chromosomu Y na chromosom X. Evans i wsp. w 1979 r. wykazali bowiem, że u 8 na 12 badanych mężczyzn z kariotypem 46,XX występuje translokacja pomiędzy końcami ramion krótkich chromosomów X i Y (translokacja Yp#Xp). Ostatnio metodš hybrydyzacji i# situ (sonda pD105) potwierdzono translokację Yp na Xp u mężczyzn XX (An#derson 1986). Również czwarta z wysuwanych hipotez znajduje potwierdzenie, szczególnie w badaniach przypadków mężczyzn XX występujšcyeh rodzinnie. Badania ostatnich lat wykazały więc, że różne przyczyny mogš prowadzić do powstania mężczyzn z żeńskim kariotypem 46,XX. Istotne okazało się również oznaczenie u mężczyzn XX antygenu H-Y, które wykazało, że stężenie jego jest takie jak u normalnych mężczyzn XY, lub jedynie nieznacznie zmniejszone, co wskazuje na genetycznš etiologię tego zespołu. Obszernego przeglšdu mężczyzn z kariotypem 46,XX dokonał de la Chapelle. Stwierdził on, że œrednia wzrostu w populacji mężczyzn XX jest niższa od œredniej wzrostu w populacji normalnych mężczyzn lub zespołu Kli 75 Ryc. 35. Mężczyzna z kariotypem 46,XX stwierdzonym w krwinkach bialych oraz w komórkach skóry i jšder: a - mężczyzna XX (Z. W.) w wieku lat 32. Zwraca uwagę męska budowa paejenta; b - zewnętrzne narzšdy płciowe; c, d = obraz histologiczny jšder. nefeltera z kariotypem 47,XXY. Stan kliniczny pacjentów, obraz histologiczny jšder oraz wydzielanie hormonów płciowych sš podobne jak w zespole Klinefeltera lub w zespole del Castillo. Częstoœć występowania osobników męskich z kariotypem XX wynosi ok. I :25 000 noworodków. Męski rozwój pł„owy z obecnoœeiš żeńskiego kariotypu opisano nie tylko 76 u człowieka, lecz również u kóz, œwiń oraz myszy. Występowanie tej ano- malii u kóz jest zwišzane z obecnoœciš autosomalnego, recesywnego genu Po- lled w stanie homozygotycznym, natomiast u myszy z #becnoœciš autosomal- nego, dominujšcego genu Sxr. M#ŻCZYNI XYY Jacobs i wsp. (1965 r.) stwierdzili wœród mężczyzn przetrzymywanych w zakładach zamkniętych z powodu swego agresywnego zachowania ponad 2o/o osobników z kariotypem 47,XYY, a więc z dodatkowym chromosomem Y. Byli oni mężczyznami o wysokim wzro#cie i o agresywnym zachowaniu (wrogi stosunek do otoczenia, pobicia, drobne przestępstwa). Badaniem ogólnym stwierdzono u nich prawidłowy rozwój wszystkich cech męskich, a więc prawidłowš męskš budowę ciała oraz owłosienie lonowe i klatki piersiowej typu męskiego; zewnętrzne narzšdy płciowe były prawidłowo męskie, jšdra prawidłowej wielkoœci i konsystencji. Na podstawie powyższych obserwacji Jacobs i wsp. (1965 r.) sugerowali, że obecnoœć dwóch chromosomów Y predysponuje do nieprawidłowego, agresywnego zachowania. Problem ten wzbudził i nadal wzbudza wiele kontrowersji, zarówno medycznych, jak i etycznych. Wiadomo bowiem, że tylko czgœć osób z kariotypem 47.XYY wykazuje agresywne zachowanie, natomiast większoœć z nich prowadzi normalne życie, a jedynš cechš występujšcš u wszystkich jest wysoki wzrost, który wynosi najczęœciej od 180 do 186 cm. Nie#tórzy lekarze i psycholodzy sš więc zdania, że w razie stwierdzenia kariotypu 47,XYY nie powinno się informować o tym ani badanego, ani jegn rodziców, by nie spowodować zaburzeń w jego adaptacji społecznej i osobistej. Należy jednak jasno stwierdzić, że u wszystkich osób z kariotypem 47,XYY ujawniajš się pewne eharakterystyczne cechy osobowoœci, które mogš prowadzić do nieprawidłowego zachowania. Sš to: 1) zwiększona pobudliwnœć emocjonalna, 2) zmniejszone panowanie nad emocjami, 3) zmniejszona zdolnoœć pokonywania strachu i obaw, 4) brak pełnej dojrzałoœci psychicznej, charakteryzujšcy się istnieniem wielu cech infantylnych. Większoœć mężczyzn XYY jest płodna. W pojedynczych przypadkach stwierdza się zaburzenia spermatogenezy, niedorozwój zewnętrznych narzšdów płciowych oraz hipogonadyzm. Częstoœć występowania kariotypu 47,XYY wynosi u noworodków 1:1000. KOBIETY XXX Pierwszy przypadek z kariotypem 47.XXX (ryc. 36) został opisanv przez Jacobs i wsp. w 1959 r.; była to kobieta z wtórnym brakiem miesi#czki, u której nie stwierdzono żadnych innych anomalii płciowych, cielesnych lub też w rozwoju umysłowym. Jako ciekawostkę warto wspomnieć, że już wczeœniej badaeze przewidywali istnienie kariotypu z trzema chromosomami X i spodziewawszy się znaleŸć taki kariotyp wœród nsób o wybitnie knbiecych cechach (super female) pod,jęli badania cyto#enetyczne wœród aktorek i statystek filmowych. Badania te doprowadziły też nieoczekiwanie do wykrycia kilku przypadkńw z kariotypem 46,XY, rozpoznanych jako zespół feminizujšcych jšder (zespół nie 77 wrażliwoœci na androgeny). Można też dodać, że kobiety XXX bynajmniej nie odznaczajš się ani szczególnš urodš, ani prawidłowoœciš w hormonalnej czyn= noœci jajników. U kobiet z aberracjš chromosomalnš XXX nie wykryto żadnych charakterystycznych zmian somatycznych, które ułatwiłyby rozpoznanie kliniczne. Jedynie w niektórych przypadkach stwierdzono zaburzenia miesišczkowania, wtórny brak miesišczki, przedwczesnš menopauzę oraz niski stopień inteligencji. U dzieci tych kobiet, wbrew przewidywaniom, rzadko stwierdza się aberracje ehromosomałne. Można bowiem było przypuszczać na podstawie kariotypu matek 47,XXX, że częœć komórek jajowych (gamet) musi mieć po jednym, a częœć po dwa chromosomy X. Brak anomałii chromosomalnych u potomstwa kobiet XXX można tłumaczyć mechanizmem, który sprawia, że w procesie mejozy oocyt II rzędu z dwoma chromosomami X staje się ciałkiem kierunkowym, natomiast dojrzewa jedynie prawidłowy oocyt II rzędu z jednym chromosomem X. Częstoœć występowania kariotypu 47,XXX wynosi u noworodków 1:1000. ZESP6Ł TURNERA Zespół Turnera chnrakteryzuje się występowaniem u kobiet niskiego wzrostu, aplastycznych dysgenetycznych gonad, infantylnych narzšdów płciowych oraz licznych wad somatycznych, takich jak płetwistoœć szyi, koœlawoœć łokci, wady wrodzone układu moczowo-płciowego, kršżenia i inne (ryc. 37). Badanie cytogenetyczne wykazuje najczęœciej kariotyp 45,X lub mozaikę 45,X/ /46,XX. 78 Ryc. 36. Kariotyp 47,XXX w badaniu fluorescencyjnym. Ryc. 37. u - przypadek zespoiu Turnera w wieku lat 18. Zwraca uwagę niski. wzrost oraz charakterystyczna sylwetka z puklerzowatš klatkš piersiowš. Nieznaczny rozwój piersi i owłosienie łonowe wystšpiły po leczeniu hormonalnym; b - płetwista szyja, niskie zarastanie włosów na karku i liczne znamiona barwnikowe na plecach; c - skrócenie IV i V koœci œródręcza; d - skrócenie IV i V koœci œródstopia dajšce w wyniku cofnięcie IV i V palca. ETIOLOGIA I PATOGENEZA Przyczynš powstania zespołu Turnera jest brak informacji genetycznej drugiego chromosomu płciowego we wszystkich lub w częœci komórek organizmu. Powoduje to spaczenie procesów rozwojowych i wzrostowyeh komórek, co daje w wyniku wady wrodzone w obrębie tkanek i narzšdów. ?# Wiadomo, że zmiany, które charakteryzujš zespół Turnera, dotyczš przede -wszystkim gonad, koœci oraz tkanki łšcznej. Milcou i wsp. wykazali, że zmiaů:ny histopatologiczne występujšce w koœciach osób z zespołem Turnera sš podobne, choć nie tak nasilone, jak te, które stwierdza się w achondroplazji, #co wyjaœnia, dlaczego wzrost tych osób jest niski, pomimo dużej lub normalnej zawartoœci hormonu wzrostu. Na podstawie powyższych danych można uważać, że nieprawidłowoœci -stwierdzane w zespole Turnera, zarówno somatyczne, jak i gonadalne, majš :swe Ÿródło we wspólnym defekcie tkanek pochodzenia mezodermalnego, takich jak koœci, tkanka łšczna oraz komórki somatyczne gonady, zarówno folikularne, jak i mezenchymalne. Informacja genetyczna dwóch ehromosomów X lub jeœli zaakceptować hipotezę Hamertona (1969 r.) o znaczeniu heterochromatyny - regulujšcej wpływ drugiego heteroehromatycznego chro:mosomu płciowego - sš konieczne do prawidłowego przebiegu procesów odgrywajšcych podstawowš rolę w rozwoju i funkcjonowaniu tkanek po-chodzenia mezodermalnego. Brak tej informacji i zaburzenie tych procesów .jest przyczynš powstania zespołu Turnera. #BADANIA CYTOGENETYCZNE #Badania cytogenetyczne wykazały, że zespół Turnera jest spowodowany mo.nosomiš chromosomu X całkowitš - kariotyp 45,X, lub częœciowš - mozaika 45,X/46,XX i podobne, albo aberracjami strukturalnymi jednego z ů#hromosomów X, najczęœciej w postaci delecji ramion krótkich lub długich tego chromosomu. Jeżeli jednak delecja ramion krótkich chromosomu X pro:wadzi zawsze do wystšpienia objawów zespołu Turnera, to delecja ramion ługich tego chromosomu, w postaci kariotypu 46,XX,de1(Xq) lub 46,X,i(Xp), ,może prowadzić tylko do uformowania się aplastycznych gonad, przy zachowaniu normalnego wzrostu i braku innych objawów somatycznych zespołu #Turnera. W większoœci przypadków zespołu Turnera nie stwierdzono chromatyny płciowej. Prawie we wszystkich tych przypadkach badania cytogenetyczne wykazały brak jednego chromosomu płciowego i kariotyp 45,X. Pacjentki z tym #kariotypem stanowiš największš grupę przypadków zespołu Turnera. Drugš grupę stanowiš pacjentki z pozytywnš chromatynš płciowš, u których najczęœciej stwierdza się mozaikę chromosomalnš 45,X/46,XX. Przypadki z kariotypem 45,X sš zwykle bardziej upoœledzone pod wzglęůńem klinicznym niż przypadki, w których występuje drugi chromosom X, #chociażby w częœci komórek (mozaika 45,X/46,XX). Rozdwojenie aorty, płetwistoœć szyi oraz inne wady sš najczęœciej stwierdzane wœród pacjentek z ka#iotypem 45,X. Wprowadzenie pršżkowych technik cytogenetycznych pozwoliło na dużo #aęstsze stwierdzanie aberracji strukturalnych chromosomu X u pacjentek z zespołem Turnera. Na przykład, autor w prowadzonych przez siebie badaniach stwierdził wœród 104 badanych przypadków zespołu Turnera w: 61 przypadkach kariotyp 45,X oraz brak chromatyny płciowej X; 22 przypadkach mozaikę chromosomalnš 45,X/46,XX, częstoœć występowania chromatyny płciowej X od 6 do 32#!!#; 4 przypadkach mozaikę chromosomalnš 45,X/46,XY oraz brak chromatyny płciowej X ; 1 przypadku mozaikę chromosomalnš 45,X/47,XYY oraz brak chromatyny płciowej X ; 80 ftyc. 38. Kariotyp 46,XX,de1(Xp) (wg Boczkowskiego i Mikkelsen) 6 - Z.arys genetyki 81 # przypadku normalny kariotyp męski 46,XY oraz brak chromatyny płcio- wej X ; 15 przypadkach aberracje strukturalne chromosomu X, w tym w: - 3 przypadkach kariotyp 46,XX,de1(Xp) - delecja ramion krótkich chro- mosomu X (ryc. 38}, chromatyna płciowa X - 0, 16, 20o#o; ttve. 39. Kariotyp 46,X,i(Xq) (wg Boczkowskiego i Mikkelsen) 82 Ryc. 40. Kariotyp 46,X,dup(X) (qter # pll : :qll -# qter) (wg Boczkowskiego i Mik- kelsen). Ryc. 41. Kat#otyp 46,X,dup(X) (qter -# g21: :q21 --ł qter) (wg Boczkowskiego i lVlik- kelsen). - 2 przypadkach kariotyp 46,XX,de1(Xq) - deleeja ramion długich chromosomu X, chromatyna płciowa X - O,Oo/o; - 2 przypadkach kariotyp 46,X,i(Xq) - izochromosom ramion długich chromosomu X (ryc. 39), chromatyna płciowa X - 10, 14o/o; - 2 przypadkach kariotyp 46,X,dup(Xq) - duplikaeja częœci ramion długich chromosomu X (ryc. 40 i 41), chromatyna płciowa X - 12, 29oi'o; #- 2 przypadkach mozaikę chromosomalnš 45,X/46,X,r(X) - kolisty chromosom X, chromatyna płciowa X - 0,5o/o; - 1 przypadku kariotyp 46,dic i(Xq) - dicentryczny izochromosom ramion długich X, chromatyna płciowa X - 20o/o; - 3 przypadkach mozaikę chromosomalnš 45,X/46,X,dic i(Xq) - chromatyna płciowa X - 14, 17, 32o/o. Ryc. 42. Pršżki QFQ oraz RBA u pięeiu pacjentek z następujšeymi aberracjami chromosomu X: 4B,X, i(Xq); 46,X, i(Xq); 49,XXX; 4B,X,dup(X) (qter # pll : :qll # qter) ; 46,X,dvp(X) (qter # p21: : q21 -# qter) (wg Boczkowskiego i Mikkelsen). We wszystkich przypadkach z aberracjami strukturalnymi chromosomu X nieprawidłowy chromosom X był póŸno replikujšcy (ryc. 42 i 43). Badania te pozwolżły również na podzielenie przypadków zespołu Turnera pod wzglę 83 Ryc. 43. Pršżki QFQ, RBA i CSG u czte- rech pacjentek z następujšeymi aberracja- mi chromosomu X : 4B,X,dic i (Xq) (pll) ; 45,X/46,X,dic i(Xq) (pll); 45,Xl46,X, dic i(Xq)(pll); 45,X/46,X,dżc i(Xq)(pll) (wg Boczkowskżego i Mikkelsen). dem cytogenetycznym na cztery grupy (kolejnoœć według częstoœci wyst2powania) : 1) przypadki z monosomiš całkowitš chromosomu X - kariotyp 45,X 2) przypadki z monosomiš ezęœciowš chromosomu X - mozaicyzm 45, X/46,XX, 3) przypadki z aberracjami strukturalnymi chromosomu X, 4) przypadki z obecnoœciš chromosomu Y. Nie udało się stwierdzie, jaki czynnik czy też czynniki etiologiczne powodujš powstawanie „berraeji chromosomalnych będšcych przyezynš zesoołu Turnera. Nie wykazano rodzinnego przenoszenia tej anomalii. Opublikowano jedynie poje-dyneze doniesien:a o występowaniu zespołu Turnera wœród rodzeństwa. Opisano również kilka rodzeństw, u których stwierdzono #vystšpienie zarówno przypadków zespołu Turnera, jak i Klinefeltera. Wskazu#A to na rodzinnš predyœpozycję do nieroz#zielnoœ„ chromosomów płciowych w komórkach płciowych ich rodziców. Nie stwierdzono starszego wieku matek lub ojców pacjentek z zespołem Turnera; stwierdzono natomiast częstsze występowanie tego zespołu wœród dzieci urodzonych przed 21 rokiem życia matki. Częstoœć występowania kariotypu #5,X wynosi u noworodków 1:10 000. Ponieważ kariotyp 45,X wyœtępuje w blisk# połowie przypadków zespołu Turnera, można przyjšć, że częstoœć występowania tego zespołu wynoœi 1:#000 noworodków, czyli 1:2500 noworodków płci żeńœkiej. P#CHODZEl#IE CHROMOSOMU X Badanie grupy krwi Xg u pacjentki z zespołem Turnera i kariotypem 45,X oraz u jej rodziców pozwala niekiedy na stwżerdzenie, czy chromosom X w przypadku zespołu Turnera pochodzi od ojca, czy matki (tab. 10). T a b e 1 a 10. Pochodzenie chromosomu X w przypadkach z kariotypem 45,X Grupa Xg Pochodzenie chromosomu # ojca matki 45,X matezyne ojcowskie :iie wyjaœnione Jeœli pacjentka z objawami zespołu Turnera i kariotypem 45,X ma antygen grupy Xg, co oznaczamy symbolicznie Xg(a-I-), i takš samš grupę krwi Xg(a+) ma jej matka, matomiast u ojca brak jest tego antygenu, to cfZromosom X pacjentki jest pochodzenia matezynego, a brak jest chromosomu płciowego pochadzenia ojcowskiego (ryc. 44). Gdyby w przedsta#vionym powyżej przykładzie ojciec był, podobnie jak matka i córka, Xg(a-f-), to ůnie można byłoby wysunšć wniosku co do pochodzenia chromosomu X u córki. Istniejš jeszeze inne możliwoœci wystšpienia tej grupy. Zarówno ojciee, iak i matka mogš być Xg(a-I-), natomiast ich dziecko z kariotypem 45,Y iest Xg(a-). Ponieważ obecnoœć antygenu Xg jest cechš dominujšcš matka uia 84 . 9 a # c' =:5 '.c,a'# c #=-c zes^ól ##; "F, ##lr.4 á5#c. 44. árze#i,o genealog:czne przypadku zespolu Turnera z kariotypem 4:i.X; auter stwierdził, że chromosom X jest tutaj pochodzenia matezynego, a brak ::atumiast chrosnosornu płcio#vego poehodzenia ojcowskiego. Poniżej symboli poetano ů## iels osób. Gvnia#šca tc;n antygen, a ##ięc bgdšca fenotypowo Xg(a=#), jest genotypowo `;g(a # ; Xg(a-). Oznacza tc;. że w jednym z jej ehromosomów X jest allel Ÿg(a7-) odpowiedzialny za wytwarzanie an2ygenu Xg, natomiast allel dru#i#go chromosomu X jest Yg(a-). Ponieważ ojcier o fenotypie Xg(a-i-) ma #-lko jeden chI-omosom płciowy X, więc w obrębie tego jednego chromosomu #i musi być umiejsco##.#iony gen odpowiedzialny za wytwarzanie ant#-genu Xg. ,Teżeli wige ciziecko tych rodziców jest Xg(a-), to jego jedyny chromosom X jest pochodzenia matezynego. W sytuaeji, gdy matka jest X#(a#-), ojciec Xg(a-), a dziecko z kariotypem #+,5X jest fenotypowo Xg(a-), nie można wysunšć żadnych wniosków co do pochodzenia jego chromosor:zu X. Jeżeli bowiem matka jest heterozygotš w stosunku do tej ceehy, a wige #enotypowo Xg(a-f-) Xg(a-), to chromosom X może być zarówno pochodzenia matezynego, jak i ojcowskiego. #ZYSTA #Y#GENEZ#A GON:##l Czysta dysgenezja gonad charakteryzuje sig #i#ystępowaniem u kobiet aplastyc,nych gonad i towarzyszšcych im cech w postaci eunuchoidalnej budow,y ciała oraz braku rozwoju piersi bez innyeh anomalii somatycznych opisywanych w zespole Turnera. takich jak niski wzrost czy inne wady udowv ciała. Jest to ##-igc zespół zwišzany jedynie z brakiem produkeji horn,onalnej gonad, i to zarówno w okresie płodowym, jak i życia osobniczego, co zgodnie z doœwiadezeniami Josta prowadzi do rozwoju eunuchoidalnego fenotypu żeńskiego, niezależnie od kariotypu pacjentki. LT przeważajšcej większoœci ko#iet z czystš dysgenezjš gonad stwierdza sie więc normalny kariotyp albo żeński, albo rzadziej męski; w obu grupach przypadków stwierdzono rodzinne wystgpowanie. Jeclynie w pojedynezveh przypadkach występujš aberracje liczbowe lub strukturalne chromosomu płciowego X czy Y, najezęœciej w postaci mozaiki 45 X!46,XX I,.zb kario# 'pu #S X,del(Xq), albo kariotypu 47.XYY lub 46,X,de1(Yp) Przeprowadzone przez aL:tora porównanie fenotypu pacjentek z kar;nty= uem żeńskim i mgskim nie ##,vkazało istotnych różnic w ich stanie klini#znym i fenotypie, z wyjštkiem wzrostu. Œrednia wzrostu pacjentek z ka#,iotyp#m 46,XX była bowiem o 6.1 cm niższa od œredniej wzrostu pacjentek z kariotypem 46,XY. co wskazuje na genetyczny wpłycv chromosomu Y na ##rzrost, nie zwišzany z cz##nnoœciš jšde:. W przypadkach czystej dysgenezji gonad z kariotype:ůn żeńskim 46,XX nie s2#;#ieraza się obecnoœci antygenLz H-Y. Przypadki z kariotypem 46,XY można natomiast podzielić na majšce antygen H-Y oraz pozbawione tego anty 85 genu. Osoby z antygenem H-Y miały prawdopodobnie przez krótki i wezesny okres życia płodowego tkankę jšdrowš, która całkowicie póŸniej zanikła. Przypadki te nie występujš rodzinnie, a przyczynš ich powstania mogły być różne czynniki teratogenne, w bardzo wezesnym okresie uszkadzajšce jšdra p#odowe. Natomiast przypadki z kar#otypem 46,XY, które nie majš antygenu H-Y, występujš często rodzinnie, co.œwiadezy o tym, że przyczynš ich występowania nie jest czynnik teratogenny, leez mutacja genu znajdujšcego się w chromosomie X lub autosomie, gdyż cecha ta jest przenoszona pizez fenotypowo normalne kobiety na ich genetycznie męskie potomstwo. Simpson i wsp. (1981) wykazali, że oprócz rodzin, w których czysta dysgenezja gonad XY jest dziedziczona jak# cecha reeesywna sprzężona z chromosomem X, istniejš również rodziny, w których jest ona dziedziczona jako cecha recesywna autosomalna; ograniczona do płci męskiej. ZESPÓŁ NIEWRALIWOŒCI NA ANI#ROGENY Jednostkš kliniunš nie zwišzanš z aberracjami chromosomalnymi jest również zespół niewrażliwoœci na androgeny, nazywany dawniej zespołem feminizujš#ych jšder, w którym stwierdza się normalny kariotyp rnęski u pacjentek o żeńskńm fenotypie, z dobrym rozwojem piersi i kobiecymi zewnętrznymi narzšdami płciowymi. Badania prowadzone w cišgu ostatnich kilku lat dostarezyły przekonywajšcych dowodów na to, że defekt powodujšcy brak wpływu androgenów w tym zespole jest wywołany zaburzenżami syœtemów stanowišcych poœrednie ogniwo w działaniu testosteronu lub jego pochodnych na docelowe akceptory. Tak więc w zespole tym jšdra wydzielajš wyœtarezajšce do maskulinizaeji iloœci androgenów, jednak androgeny te nie zostajš zużytkowane przez organizm. Przyezynš zaburzeń jest w ezęœci przypadków defekt eytoplazmatycznego białka receptorowego, które w obrębie komórki przekazuje z kolei czšsteczki androgenów do receptorów jšdrowych; w częœci pr#ypadków natomiast, pomimo obecnoœci prawidłowego cytoplazmatycznego białka receptorowego, nie dochodzi do wply#vu hormonu na akeeptor jšdrowy. Takim akceptorem jšdrowym może być albo białkowy represor, który po połšczeniu się z testosteronem traci swoje hamujšce działanie, albo odpowiedni odeinek DNA chromosomu. Zespół ten, spowodowany mutacjš genetycznš, jest przenoszony przez fenotypowo normalne kobiety na ich genetycznie męskie potomstwo, jako eecha dominujšca autosomalna ograniczona do płci męskiej, lub jako cecha recesywna sprzężona z chromosomem X. Analiza rodowodów, w których stwierdzono wiele pacjentek z tym zespołem, nie pozwoliła, jak na razie, na okreœlenie, która z powyższych hipotez dotyczšcych jego dziedziczenia jest słuszna. Badania myszy, wœród których również występuje taki zespół, pozwnliły jednak na stwierdzenie, że jest on dziedziczony jako cecha recesywna sprzężona z chromosomem X, #o wobec dużego podó#ieństwa roli chromosomu X u ssaków pozwala przypuszezać, że ten typ dziedziczenia występuje również u l,.xdzi. Zostało to ostatecznie potwierdzone umiejscowieniem genu odpowiedzialnego za wytwarzanie specyficznego eyt#plazmatycznego białka receptorowego w stosunku do an#r#genów w częœci przycentromerowej ramion krótkich chromosomu X człowieka. 86 #ODSUMOWANIE Cyto#enetyka człowieka w pierwszym o#sresie swojego rozwoju dokonała szezególnie dużego postępu w badaniu aberracji chromosomów płeiowych. Badania te pozwoliły na stwierdzenie, że zespół Turnera jest spowodowany monosomiš chromosomu X, cał:rovcńtš (:tariotyp 45;X) lub częœciowš (mozaika 45,X/46,XX i po#obne) albo aberracjami strukturalnymi jednego z chro#nosomów X. #V ze.spole Klinefeltera badania eytogenetyczne wykazały, że jest on spowodowany obecnoœciš jednego lub kilku dodatkowych chromosomów X przy jednoćzesnym iœtnieniu chromosomu Y (.kariotyp 47,XXY, mozaika 46.XX/47,vXY i inne). Badania cytog#netyczne pozwoliły na okreœlenie etiologii chromosomalnej wielu innych przypadków nieprawidłowej determinacji i różnicowania płci oraz na sprecyzowanie mechanizmu genetycznej determinacji płci, w którym decydujšcš rolę odgrywa męski chromosom Y. Okreœlenie grupy krwi Xg, której gen jest umiejscowiony w chromosomie X, umożliwia przeprowadzenie analizy, jakiego pochodzenia jest chromosom X w przypadkach aberraeji chromosomalnych, takich jak 45,X, 47,XXY i podobne. Chromatynę płciowš możemy podzielić na stwierdzanš w jšdrach komórek żeńskich chromatyn#,płciowš X oraz na stwierdzanš w jšdrach komórek męskich, jasno fluoryzujšcš grudkę nazywanš ciałkiem Y. Szybki postęp w badaniu aberracji chromosomów płciowych był możliwy dzięki pomocniczemu testowi chromatyny płciowej X, który jako proste, wstępne badanie diagnostyczne pozwolił na wyłowienie z wielkich populacji nielicznych stosunkowo przypadków nieprawidłowej determinacji płci. Z drugiej strony analiza cytogenetyczna potwierdziła oraz wyjaœniła wezeœniejsze badania nad występowaniem negatywnej chromatyny płciowej X w przypadkach zespołu Turnera oraz pozytywnej w przypadkach zespołu Klinefeltera. Istniejš również zespoły nieprawidłowego rozwoju płciowego, takie jak czysta dysgenezja gonad lub zespół niewrażliwoœci na androgeny, które sš spowodowane nie aberracjami chromosomalnymi, lecz mutacjami genetyćznymi. #. .,#berra#je autosoma#### Krzysztof Boczkot,uski. #a;c:zęœciej stwierdzanymi aberracjami autosoznalnymi s# trisomie, które powodujš nieprawid#owoœci w rozwoju osobnika wskutek nadmiaru materiału genetycznego. Do chwili obecnej nie opisano natomiast osobnika z calkowitš monosomiš któregoœ z autosomów, gdyż ma to skutki letalne, z wyjštkiem nien;owlšt z monosomiš 21, które zwykle nie żyjš dłużej niż kiika minsięcy. Należy zdać sobie sprawę, że na ogół żadna anomalia fenotgpowa nie występuje wyłšcznie w jednym zespole chromosomalnym lecz że każdy z nich charakteryzuje się współistnieniem wielu anomalii, które z większš częstoœciš występujš właœnie w danym zespole chromosomalnym. Mażna jednak stwierdzić, że pewne charakterystyczne objawy wysżępuja tak rzadko w żnnych zespołach chorobowych, że sš one charakterystyczne tylko dla okreœlonego zespolu. Na przyklad dla zespołu delecji 5p - charakteryst5#ezny jest płacz przypominajšcy miauczenie kota* oraz przedwezesne si ##;%#:; Niederozwój un,:ysT#wyt.#. Wrcdz#ne waly serc# Ryc. 4:i. Wspólne objawy występujšce w trżsomiach autosomalny ch (## # Vogela i #1otulskiego). * #tšd francuska nazwa zespołu - cri du chat. 88 wienie włosów. Natomiast dla trisomii chromosomów nr 13 c#arakterystyczna jest polidaktylia ršk i stóp oraż przetrwanie hemoglobiny płodowej (HbF). Dla trisomii 18 charakterystyczne jest zachodzenie drugiego palca ręki na trzeei, a pištego na czwarty. U prawie wszystkich osób z aberracjami autosomalnymi v#ystępuje natumiast większy lub mniejszy stopień niedorozwoju umysłowego (r5- c. 45). Fakt ten nie wzbudzi zdziwienia, jeœli uœwiadomimy sobie, jak bardzo skotnnlikowanym organem jest oœrodkowy układ nerwowy. Również zmniejszenie wzrostu lub jego wyraŸne zaburzeńia występujš w większoœei zespołów chromosomalnych, z wyjštkiem trisomii chromosomów nr 8 oraz trisom ramion krótkich chromosomów nr 20. Dalsze charakterystyczne objawy to zniekształcenia czaszki i twarzy. a zwłaszeza małżowin usznych, oraz wady serea. W niniejszym rozdziale przedstawiono zespoły chorobowe, w których stwierdza się anomalie autosomalne. Większoœć tych chorób, jak zespół "cri du chat". zespół Patau„ lub zespół Edwardsa, zostala wyodrębniona dzięki badanior#s eytogenetycznym. Natomiast najezęœciej #i- ystgnujšcym i ma;šcym naj###iększe znaczenie kliniczne jest zespół Downa. ##SPÓł. DO##NA ##ajezęœeiej stwierdzanvnzi objawami zespolu Downa, oprócz niedorozvvoiu umysłowego, sš: niski wzrost, nieprawidło#x,e ;#roporeje ciała, skoœne u# awienie s?par powiekowyeh z obecnoœciš zmarszezki nakštnej, obniżenie napięcia mięœniowega, niepra#vid?owoœci zębów, duży, pobrużdżony język. wvsol:ie i wšskie podniebien:e, krótki nos, krótka szyja, krótkie sz#rokie dłonie i palce, charakterystyczne nieprawidłowoœci dermatoglifów oraz wiele #;#ad wrodzonych narzšdów wewnętrznych (ryc. 46). Pomimo znacznego upoœledzenia umysłowego osoby te majš możliwoœć osišgniecia pewnegó stopnia rnz !diski #vżrost Niedorozwój umysTowy PLnska potylica Zniekszta Tcenin usz Wiefe "p#tlic"na opuszkach palcow MaTpia bruzda #ednost^onny lub obustronny bruk jedne9o żebrc> Zwężenia przewodu pokarmowego Przepuklina pępkowa Wady wrodzrne macicy Hipotonia mięœniowa ^uże palcel duży od5tgp pom:#dzy I i fl pc:!cnm stóp Szercka i pTaska twarz ,,#"#; ##, ;n t#, Skoœne oczy # Zmcrœżezka nokatnn Y" Krótki noœ MaTe i Tukowate podniebienie Duży,pobrużdżonyjęzyk Nieprawidlowoœci uzębienia Krótfnym jest sprawa, czy matka majšca jedno dziecko z zespołem Downa jest narażona na większe ryzyko panownego urodzenia dziecka z tym zespołem niż matka, która ma normalne dziecko, lub też nie rodziła. Carter i Evans, k#órzy badali rodzeństwo 642 pacjentów z zespołem Downa, wykazali, że na ogólnš lirzbę 312 braci i sióstr u 5 również œtwierdzono zespół Downa, c#ociaż przez porównanie z populacjš osobników normalnych należaloby spndziewać się tylko I przypadku zespołu Downa. Na podœtawie powyższego przyjęto, że posiadanie dziecka z zespołem Downa zwiększa możliwoœć urodzenia następnego dziecka z tym zespołem. Badania cytogenetyczne pozwoliły na udzielenie bardziej szczegółowej ż miarodajnej odpowiedzi matce, która ma dziecko z zespołem Downa i która przychodzi do lekarza z zapytaniem: "jakie jest prawdopodabieństwo, że mo#e następne dziecko będzie również mialo zespół Downa". We wszystkich takich przypadkach niezbędne jest wykonanie badania cytogenetyc2nego za#:ńwno u rodziców, jak i u dziecka z zespołem Downa. Jeżeli w przypadku zespołu Downa stwierdzi się 47 chromosomów oraz trisomię 21, a garnitur ehromosomalny zarówno u ojca, jak i u matki jest prawidłowy, to ryzyko wystšpienia zespołu Downa u drugiego dziecka wynosi 1 - 2o/o, niezależnie od wieku matki. W zwišzku z tym dodatkowe ryzyko w stosunku do przeciętnego ryzyka, jakie ponosi każda matka będšca w cišży, zależy w znacznej miexze od wieku matki. Jeżeli wiek matki jest poniżej 35 lat, ryzyko to jest 6 razy większe niż przeciętne. Natomiaœt jeœli matka jest w wieku powyżej 35 lat, ryzyko jest takie samo jak u innych kobiet. Jest to spowodowane tym, że u starszej kobiety ryzyko wystšpienia 96 T a b e 1 a 12. Typ aberracji chromosomalnych dia- gnozowanych prenatalnie po pierwszym dzieeku z ze- społem Downa (wg Mikkełsen i Stenc) Aberracje Liczba przypadków Trisomia 21 7 Trisozria 18 47,XXY 47,XXX 1 46,XX,inv(19) 46,XX,inv(12) 46,XY/4„,X 46,XX/46,XX,dL;p(17q) 46,XY,t( 7 ;21) (q22;q22) 46,XY,marker Razem 17 zespołu Downa jest doœć znaczne (ok. lo#o) i w z#=:išzku z tym nie różni się ono od ryzyka u matki, która urodziła już jedno dziecko z zespołem Downa# W przypadku stwierdzenia translokacji u któregoœ z rodziców lub też u dziecka z zespołem Downa ryzyko wystšpienia tego zespołu L# następnego dziecka znacznie wzrasta. Dokładne okreœlenie zależy od typu translokacji, jednak zawsze jest ono znacznie większe niż przeciętne. W przypadku takim należy zalecić przeprowadzenie diagnostyki prenatalnej (tab. 12). TRISOMIA Clfi#OMOSOMÓW NR 13 - ZESPÓŁ PATAUA Patau i wsp. w 1960 r. znaleŸli dodatkowy chromosom w komórkach szpiku kostnego u noworodka plci żexiskiej z następujšcymi #vrodzonymi anomaliami: obecnoœciš tylko jednego oka, rozszezepem podniebienia, polidaktyliš. Były również objawy uszkodzenia mózgtz oraz wrodzonej wady serca. Dodatkowy chromosom znaleziony w tym przypadku interpretowany był jako autosom z grupy 13 - 15. Dalsze badania wykazały, że jest to chromosom 13 (ryc. 53). lVajez꜄ej stwierdzanymi objawami klinicznynli c# tym zespole sš: niedorożwój umysłowy, wady oczu, nisko osadzone i zdeformowane uszy, rr>zszezep warg i podniebienia, polidaktylia, wrodzone wady serca. Rzadziej stwierdzanymi wadami sš: głuchota, wšskie paznol:cie, dodatkowa œledziona anomalie w obrębie układu moczowo-płciowego, przepuklina pęp#owa, kryptorehizm i niedorozwój moszny u płci męskiej oraz dwurożna macica u noworodków plci żeńskiej (ryc. 54). W większoœei przypadków trisomii nr 13 wywiady nie wskazujš na dZiedziczne obcišżenia. Opisano jednak pojedyneze osoby z trisomiš nr 13, którveh rodzeństwo wykazywało abe:racje chromosomalne innego typu. ?`.#ioŸe to być przypadkowa zbieżnoœć ## występowaniu aberracji chromosomalnych albo rodzinna skłonnoœć do występowania niepra##idłowoœci ch.romnsomalnych. Opisano również p:zypadki wystęnowania tr:somii 13 oraz innZ#ch aherraci# chromosomalnych u tego samego osobnika. Noworodki z trisomiš 13. nawet jeœli urodzš się żywe, majš bardzo krótki okres przeżycia. Okolo 45o#o umiera w czasie pierwszego miesi#ca. a 90o#o w czasie pierwszych œzeœciLz miesięcy życia. Mniej niż 5o#o oœišga 3 rols życia. Częstoœć występowania trisomii 13 wynosi u noworodków 1:12 000. 9 - Zarys genetyki 97 1 13 14 15 1# #7 #yc. 53. Kariotyp 49,XX,-j-13. Pršżki G (wg Philipa). Ńiski wzrost i MaTomózgowie Niedorozwój umysTowy ' Szerokie rozstawienie Szc?elina wtęczówc# gaT#h ocznych T#isko osad?one i znieksztaT- ## Rozszczep wargi i cone uszy ,r#~##"# podniebienia Poliddktylia G!uchota ZnieksztaTcenie pazr,ekci ;-laTpia bruzda Torbielowatoœć nerek Otwćr migdzyprzed- sionkowy r Podwójny moczowód Ot-wór międzyko norowy # Wodonercz# Serce po stronie praw2j Pr#epuklina pgpkowa Wiodzone ##vady maeicy Wnętrcstwo fluża fragmentacja granulocytow oraz duża -czgstoœ# występowania jqder z formami paTeczkowatymi ttyc. 54. Główne objawy kliniczne trisomii 13 (wg Vogela i Motulskiego). TRISOMIA CIIROMOSOMóW NR 18 - ZESPóŁ EDWARDSA Edwards i wsp. w 1960 r. opisali dndatkowy chrumosom z grupy E w hodo-wli komórek skóry i mięœni dziecka płci żeńskiej z licznymi wadami wrodzonymi. Głównymi wadami somatycznymi były: nieprawidłowo zbudowan# czaszka, nisko położone oraz zdeformowane uszy, mała żuchwa, płetwistoœćszyi o.raz otwór międzyprzedsżonkowy w sercu, a panadto niedorozwój umysłowy. Dzieck# zmarło w 4 miesišcu życia. Otwarte œzwy czaszki i szerokie ciemiqczkci przy urodzenlu Nisk i wzro st Szerok ie rozstawienie gaTek 0C Zny Ch Niedorozwój umysTowy # #. #(ysokie Tuki br#viowe Wystaj#ca potylica ;",### " ##;i# # Nisko osadzone i znieksztaTcone usz# Retrofteksja gTowy # #####'jw ri Niedorozwój Ÿuchwy I=uki na trżech tub # Zachodzenie pa[ców na siebie więcej opuszkach aatców PrzetrwaTy przew#d tętniczy MaTpia bruzda Otwór międzyprzedsionkowy Krótki mostek # UchyTek jelita k#gtego[Meckela/ Pderka podkowiasta ' #. NieprawidTowoœci poœladków Hipertonia mięœniowa Wielowodżie Wystqj4ce ko[ana MaTe Tożysko krzywienie dużych alcow Ryc. 55. Główne objawy kliniczne trisomii 18 (wg Vogela i Motulskiego) Na podstawie powyższej pracy oraz doni#ień dalszych autorów wyłonił si# obraz charakterystycznych anomalii somatycznych, zwišzanych z trisomiš chromosamów nr 18 (ryc. 55). Kariotyp tych przypadków zapisujemy: 47,XX,#-18 lub 47,XY,-f-18. Charakteryzujš się one ogólnym niedorozwojem, podobnie jak przypadki tris4mii chromosomów 13, oraz małymi, zdeformowanymi i nisko osadzonymi usżami i małš brodš. Palce ršk wykazujš eha= rakte#ysty#zne zachodzenie na siebie. Prawie wszysry pacjenci majš wrodzone wady serca. Chorzy dotknięcż trisomiš 18 żyjš bardzo krótko i zwykle umierajš w okresie niemowlęcyrn. Okoł4 30o#o umiera w pierwszym miesišcu życia, a jedynie 10o/o osišga 1 rok życia. Stosunek występowania tej trisomii u noworod= ków męskich i żeńskich wynosi 1:3. Przewaga w tym zespole noworodków płci żeńskiej może tłumaczyć się bardziej letalnym charakterem tej aberracji u płodów męskich, które obumierajš już w okresie życia œródmacicznego. Częstoœć występowania trisomii chromosomów 18 wynosi u noworodków 1 : 7500. 99 'DELECJA ftAlViION KftÓTKICH CHROMOSOMÓW NR 5 - ZESPÓŁ . CR# DU CHAT" W 1963 r. Lejeune i wsp. opisali u trzech noworodków częœciowš delecję ramion krótkich chromosomu z grupy B, który okreœlili jako chromosom nr 5 (ryc. 56). Opis dalszych przypadków, stwierdzonych zarówno wœród dzieci, jak i osób dorosłych, oraz szczegółowe dane kliniczne uprzednio opublikowanych przypadków zostały podane przez Lejeune'a i wsp. w 1964 r. Z op?sów tyeh ###yłonił się charakterystyezny obraz kliniczny, obejmujšcy następujšce objawy: szczególny płacz przypominajšcy miauczenie kotacri du chat (polska nazwa: zespól "miauczenia kota"), niedorozwój umysłovrs, malomózgowie, hipotonia mięœniowa, niskie osadzenie uszu, mala żu#hwa, rozszczep podniebienia oraz inne nieprawidłowoœci somatyc#ne (ryc. 57). Kariotyp takich przypadków zapisujemy: 46,XX,de1(5p) lub 46,XY,de1(5p). Wielkoœć delecji ramion krótkich chromosomu 5, powodujšca zespól "cri du chat", jest bardzo różna - od drobnych delecji terminalnych aż do utraty ok. 60a;!# długoœci ramion krótkich. Podobnie jak w innych zespołach chromosomalnych, obecnoœć mozaiki z normalnš liniš komórkowš zazwyczaj znacznie łagodzi obraz kliniczny teóo zespołu. Częstoœć występowańia delecji ramion krótkich ehromosomu 5 wynosi u no#worodków 1:#0000. Natomiast w zakładach dla osób umysłowo upoœledzonych jest ona znacznie większa. „# li 2 Hyc. 56. Kariotyp 46,XX,de1(5p). Pršżki G (wg Philipa). 100 ##: I#I## ZF.SP##;## #ZITO;g#DMALI#TE AYFnRACJE LICLh#t#' nyc. 57. Dziewezynka z zespołem "cri du chat" (cvg de Grouchy). Poz#: podanyzni powvżej trisomiami chromosomów 21, 13 i 18 jedynie trison;ia 22 występuje w stanie niemozaikowym. Trisomie pozostałych autosomó###. jeżeli występujš w stan„e niemozaikowym, to prawadzš do œmierci już w życiu plodowym. lVajezęœciej stwierdza się w postaci mozaiki, z normalnš Iini;Ł komórkowš, trisomie chromosomów 7, 8 i 9; opisano również pojedyncze przypadki mozaiki z trisomiš nr 10. Monosomia stwierdzana u żywo urodzonych dzieei dotyczy jedynie chromosomu 21, a przypadki takie okreœlajš niektórzy jako "antymongolizm". AIiE#RA#JE S'TR.rJKTUft lLNE Poza zespoiel#z.,cri du chat" najezęœciej stwierdzanymi delecjami sš: delecja ramion krótkich chromosomu nr 4 (tzw. zespół Wolfa i Hirsehhorna), deleeja ramion ~rótkich ehromosomu 18 oraz delecja ramion długich chromosc>nzu 18. Opisan;> również delecję ramion krótkich lub długich innych chromc>snn,ó;# n##. 9. 11 i 12. Wszystkie one prowadzš do okreœlonyeh zespołów chorobowych, które jednak nie będš omawiane ze względu na ogromnš rzadkoœe #vystępov##ania. Rów-nież chrc>mosomy koliste powadujš występowanie licznych zaburzeń rozwojowyeh, #;ińre jednak w Rriększoœci przypadków nie dajš się połšczyć z aberracjš okreœlonego chromosomu i nie tworzš #v ten sposób, w więk#.:#oœei przypadków, zdefiniowanych zespołów chorobowych. 101 TftIPLOIDIA I TETftAPLOIDIA B””k i Santesso,n jako pierwsi opisali triploirlię w częœci komórek w hodowli skóry jednorocznego chłopca. Wystšpiło u niego wiele defektów somatycznych oraz głęboki niedorozwój umysłowy. Analiza cytogenetyczna wykazała, że autosomy były triploidalne, natomiast chromosomy płciowe występowały w skład#ie XXY. Jedynie częœć komórek wykazywała 46 chromosomów. Triploidia jest częstš pxzyczynš poronień przed ósmym tygodniem życia płodowego. Około 20o/o płodów z aberracjami chromosomalnymi wykazuje triploidię. flpisano jedynie pojedyncze przypa#ki żywyeh noworodków z triploidiš. Chorzy z triploidiš bard#o rzadko majš zdolnoœć przeżycia okresu płodowego lub pierwszych miesięcy życia. Opisano natomiast dużo więcej żywo urodzonych osobników z mozaikš triploidia/diploidia. Wszyscy oni charakteryzowali się niedorozwojem umysłnwym i fizyeznym. W przypadkach, w których stwierdza się układ chromosomów płciowych XXY, może występować również obojnactwo zewnętrznv#" narzšdów płciowych. Płody z tetraploidiš sš jeszcze bardziej upoœledzone pod względem izmysłowym i fizycznym i jeœli nawet urodzš się żywe, to tylko wyjštkoevo przeżywajš pierwsze miesišce życia. Pft#cEsv aowoTwoftowE Zwišzek aberracji chromosomalnych z procesami nowotworowymi, i to z;równo przebiegajšcymi w postaci guzów, jak i zmianami obejmujšcymi komórki kr#vi, został udowodniony. Nie oznacza to jednak, że okreœlono, w jakim stopniu zmiany chromosomalne sš przyczynš procesów nowotworowych. Wykazan'e np. zwišzku między rozrostem nowotworowym a różnego rodzaju aberr^#jami ehromosomalnymi nie œwiadczy o tym, że zmiany chromosomalne sš przyczynš powstawania nowotworów. Levan i wsp. następujšco podsumo#vali badania chromosomów w zmianach nowotworowych: "1. Większoœć nowotworów złoœliwych wykazuje aberracje chromosomalne zarówno liczbowe, jak i strukturalne, przy czym różnorodnoœć obrazów tych zmian może być ogromna nawet w obrębie tego samego guza. Wiele guzów wykazuje jednoczeœnie obecnoœć tzw. markerów chromosomalnych, będšcych strukturalnie nieprawidłowymi chromosomami, charakterystycznymi dla danego guza. 2. Większoœć komórek guza należy do jednej podstawowej linii komórkowej. W czasie wzrostu nowotworów lub przerzutów nowotworowych linia ta ulega zwykle przemianom na wiele nowych lin komórkowych, co powoduje coraz większš różnorodnoœć obrazów cytogenetycznych zmiany now otworowej". Procesem nowotworowym, który jako pierwszy udało się povc,išzać ze stałš zmianš chromosomalnš, jest białaczka. Badaczami, którzy wykazali zwišzek między charakterystycznym typem aberracji chromosomalnej a białaczkš, byli Nowell i Hungerford. Autorzy ci badajšc krwinki białe z krwi obwodowej, opisali istnienie małego, akrocentrycznego chromosomu, zwanego Phl (Philadelphia), w wielu przypadkach przewlekłej białaczki szpikowej. Nieprawidłowy chromosom jest to chromosom nr 22 z delecjš ramion długich; kariotyp zapisujemy: 46,XX,de1(22q) lub 46,XY,de1(22q). Obserwacja ta została potwierdzona przez następnych badaczy i obecnie uważa się, że zwišzek przewlekłej białaczki szpikowej z istnieniem chromosomu Phl jest w pełni udo 102 #wodniony. Obserwacja Nowella i Hungerforda stanowi również pierwszy przykład zwišzku między charakterystycznš a2xomališ chrom#somalnš a procc;em nowotworowym. Chromosom Ph1 powstaje w wyniku delecji ż translokacji częœci ramion długich chromosomu 22 do któregoœ z większych chromosomów, najezęœciej do ramion długich chronxosomu 9. Komórki zawierajšce chromosom Ph' Lworzš klon, powstały w wyniku rozmnożenia się je#xxej komórki, w której nastšpiła delecja ramion długich chromosomu 22. Jednoczeœnie z nasilaniem się u pacjenta objawów chorobowych białaczki wzrasta liczba komórek, w których stwierdza się chromosom Phl. PóŸniejsze badania cytogenetyczne prowadzone na materiale różnyeh typó##= białaczek potwierdziły istnienie nieprawidłowoœci chromosomalnej (chromosomu Phl) w przewlekłej białaczce szpikowej. Chociaż nie udało się znaleŸć stałego z###išzku między innymi typami białaczek a anomaliami chrozni:somalnymi, to ukazało się jednak wiele publikacji o istnieniu aberracji chromosomalnych w innych typaeh białaczek. Jednym z charakterystyc#xych markerów chromosomalnych jest "wydłużony" chromosom 14 w zwišzkL z transloka#jš 8q-;14q-# spotykamy w chłoniaku Burkitta i innych rozrostach limfoproliferacyjnych B-komórkowych oraz w ostrych białaczkach B- k4mórkowych. Ponadto dosyć charakterystyczne zmiany kariotypu komórek białaczkowych towarzyszš przejœciu białaczki szpikowej z fazy przewlekłej w ostrš: naddatek chromosomu 8, dodatkowy Phl, izochromosom 17. Dosyć charakterystycznš zmianš w ostrej białaczce mieloblastyrznej jest translokacja: 8;21, a w ostrej promielocytowej translokacja: 15;17. Cytogenetyka hematologiczna zysku;e więc coraz większe znaczenie w diagnostyce oraz #v pro#nozie. Innym procesem nowotworowym, który u wielu pacjentów ma zwišzel: z aberracjš chromosomalnš, jest retżnoblasto'm,a. Najezęœciej predyspozycja do występowania tego mowotworu jest dziedziczona jako cecha autosomalna dominujšca i nie majaca Ÿadnego zwišzku z aberracjš chromosomalnš. Istniejš jednak również takie pxzypadki, w których retżnoblaston2,a występuje #vspólnie z licznymi wadami wrodzonymi u pacjentów z delecjš cz#œci ramion długieh chromosomu 13, a konkretnie odcinka l3ql4. Brak materiału genetycznego tego właœnie odcink, r#,r;##n długich chromosomu 13 powoduje brak informacji genetycznej lub tRkš zamianę strukturalnš genu lub genów, która prowadzi o wystšpienia tego procesu now#tworowego. W rodzinach, #v których stwierdza się szezególnie rzęste występowanie nowotworów, analiza cytogenetyczna jest pożšdana, gdyż może ona wykazać drobnš aberrację strukturalnš, przekazywanš dziedzicznie. Jednym z najbardziej znaczšcych os:šgnięć współezesnej genetyki medycznej jest odkrycie, że specyfiezne geny, zwane onkogenami, sš bezpoœrednio zwišzane z różnego rodzaju nowotworami (patrz tab. 13). ftównie ciekawym odkryciem było stwierdzenie obecnoœci sekweneji DN#, prawie identycznych jak w onkogenach, w materiale genetycznym normainych komórek całego œwiata zwierzęcego. Powstała teoria, że takie "protoonkogeny" rozwinęły œię ewolucyjnie i pełniš w normalnych tkankach ważnš funkeję przy podziale i różnicowaniu komórek. Wysiłki genetyków skupiajš się obecnie na odkryciu, w jaki sposób nieszkodliwe dla komórki protoonkogeny przekształcajš się w aktywne onkogeny. Wydaje się, że przyczynš jest mutacja wywołana działaniem promieniowania, zwišzku chemicznego lub wirusa. Innš bezpoœredniš przyczynš powstania nowotworu może być przemieszezenie protoonkogenu z jednego chromosomu na drugi. Tak rozwija się chłoniak 103 T a b e 1 a 13. Mapowanie gen#w majšcyeh znaczenie w ehoro#ach nowotworo- wyeh (wg MeKusicka 19&7o) Nazwa Gruczolakorak nerki (rak jasnokomórko#vy) Siatkówezak Rak płuca drobnokomórkowy (anaplastyczny) Białaczka limfatyczna z komórek T Zwojak zarodkowy współezulny (neuroblastoma) Osteosarco#n.a Ostra białaczka limfatyczna Ostra białaczka limfatyczna z komórek T Białaczka limfatyczna (przewlekła) z komórek B Białaczka limfatyczna z komórek B Przewlekła choroba ziarniniako#va Przewlekła bialaczka szpikowa #"Gonadoblastoma w zespo?e WAGR * Zespół limfoproliferacji (ehoroba Duncana) Chromosom Uwagi (loka?izacja) 3p14,2 prow. 13q14.1 potw. 3p23-p14 p4tw. 14q11.2 potw. lpter-p31 prow. 13q14.1 prow. 4q21 prow. llpl5 prow. llql3,3 potw. 18q21.3 potw. Xp21.2-p21.1 potw. 22q11.21 potw. 9q34.1 potw. llpl3 potw. Xq24-q26 # prow. potw. - lokalizacja potwierdzona prow. - lokalizacja prowizoryczna * Zespół WAGR - Wilms tumour, aniridia, gonadoblastoma, retardation. o á2cKusick, V. A. The hu#wxan gene nzap, John's Hopkins liospital, Baltixnox,e, 1989. Burkitta, nowotwór wywodzšcy sie z limfocytów B. Najezęœciej występuje on w Afryce, ale ostatnio znaleziono go również u ofiar AlDS. U ludzi zdrow# ch protoonkogen nazwany 2iaye zlokalizowany jest na chromosomie 8, natomiast u chorych na chłoniaka występuje na chromosamie 14. Na skutek takiego przemieszezenia myc na ehromosom 24 - ankogen znajduje się w pobliżu genów normalnie kontralujšeych v##ytwarzanie przeciwciał przez limfocyty B. Sš to komórki, które podlegajš transformacji nowatworowej w przypadku chloniaka Burkitta. Badacze podejrzewajš, że sšsiedztwo onkogenu i gen"#v kodujšcych przeciwciała prowadzi do interakeji, która jest bezpoœrednia przyczynš nowotworu. Uważa się obecnie, że proces powstawania nowotworu jest zazwyczaj bardżiej skomplikowany i bierze w nim udział kilka ankogenów. Kultury t#ankowe normalnych tkanek en-#brionu szezura tylko wtedy ulegajš transformacji nowotworowej, jeœli obecne sš jednoczeœnie dwa onkogeny rrzyc i ras. Istnieje podejrzenie, że jeden z tyeh onkogenów odpowiedzialny jest za przekształeenie normalnej komórki w komórkę nowotworowš. a drugi warunkuje normalnš tendeneje komórek rakowych do podziałów i ńiepohamowanego v#zrostu. Zbadano już jeden z możliwych sposobów interakeji dwóch ankogenów indukujšcych niepohamowane rozmnażanie komórek. W hodowli nie dzielšcych się komórek tkanki łšcznej eziowieka gen myc nie ujawnia się. Dz:ałanie je#o zastaje zapoczštkowane przez dodanie do hadowli czynnik# wzrostowego płytek krwi (białka zwanego PDGF), które normalnie odpowiedzialne jest za gojenie ran. Badacze wykazali też, że inny onkogen, zwany sżs, wytwarza białko niezwykle podobne do PDGF. Interakeja białka onkogenu sżs z onkogenem #n.yc może zapoczštkować proces transformacji nowotworow,ej. Protoonkogeny mogš także stać się ankogenami przez amplifikację, czvli nagromadzenie w dużych iloœciach w czasie podziału komórki. Zjawisko to zo 104 sta#o zaobserwowane w niektóryoh nowotworach komórek nerwowych i je- lita. Obecnoœć w komórkach nowotworowych dużych iloœci białek kodowa- nych pxzez geny po#vstałe na skutek amplifikacji może być wykorzystana do specyficzny ch testów diagnostycmyeh. RODZINNE WYST POWANIE ABERRACJI CIiRO#IOSOMALNYCIi VC#' niektórych rodzinach stwierdza się występowanie aberracji chromosomalnych u dwóch lub kilku jej członków. Na przykład w rodzinie opisanej przez #nrzkowskiego i wsp. w 1969 r. stwierdzono cechy zespołu Turnera oraz kariotyp 45,X zarówno u probanda, dziewezynki lat 14, jak i u 40-letniej siostrr jej ojea. Przytoczone dane można rozpatrywać jako: 1) dowód rodzinnego występo#e,ania i dziedziczenia zespo#u Turnera, 2) przypadkowe wystšpienie tej anomalii u dwu rzłonków rodziny, 3) rodzinnš predyspozycję do utraty chromosomu lub nierozdzielnoœei w okresie podziału mejotycznego komórek płciowych, istniejšcš w rodżinie ojca. Ponieważ uprzednio nigdy nie op?sano wystepow ania rodzinnego zespolu Turn#ra, natomiast wy stępowanie anomalii ch:;nmosomalnych u kilku rzłonków rodziny było opisywane przez kilku autorów, wydaje się, że trzecie z przedstawionych wyjaœnień jest najbardziej prawdopodobne. Opisano wiele rodzin, w których stwierdzono występowanie zespołu Klinefeltera (karintyp 4'7,XXY) oraz zespołu Downa (trisomia 21) u rodzeństwa lub u innych człanków rodziny w poprzednich generacjach. Podobne dane uzyskano na temat zespołu Turnera (kariotyp 45,X) i zespołu Downa. Hecht i wsp. opubiikowali dane kilku rndzin, w któryeh stwierdzono jednoćzesne występowanie zespołu Downa oraz trisomii 18. Dalsze badania tych aute,rów wykazywały również wiele rodzin, w któryeh #vystępowało wiele aberracji chromasomalnych. W jednej z nich dziecko z zespołem Downa miało ciotkę z kariotypem 45,X oraz dysgenezjš gonad, w innej natomiast dziecko z kariotypem 45,X miało kuzyna z zespołem Downa. Na podstawie obserwacji własnycli przypadków oraz danych z literatury autorzy ci słusznie uważajš, że wyst#powanie w jednej rodzinie wielu anomalii chromosomalnych nie jest prostym przypadkiem, lecz downdem rodzinnej skłonnoœci do występocvan;a anomalii chromosomalnych. PO S#J###WANIE lVajezęœćiej stwierdzanymi aberracjami autosomalnymi sš triso:'nie c##romosorrzalne, powodujšce nieprawidłowoœci w rozwoju osobnika wskutek nadmiaru materiaiu genetycznego. Badania cytogenetyczne umożliwiły ustalenie chromnsomalnej etiologii zespołu Downa (obecnoœć dodatkowego chromosnmu nr 21), jak również wyodrębnienie kilku zespołów klinicznych: z#spół Palaua - trisomia chromosomów nr 13, zespół Edwardsa - trisomia chromosnmów " j ; nr 18, zespół "cri du chat - delec a ram on krótkich chromosomu nr 5. ##ydaje się, że dokładniejsze wyjaœnienie znaaenia wielu aberracji chromosr#malnyc# u człowieka będzie możliwe dopiero z chwilš wprnwadzenia szernkich badań cytogenetycznych wœród populacji nnrmalnej. Jednak juŸ ob#cnie badania aberracji chromosomalnych, dzięki wprowadzeniu dokładnyeri technik pršżknwych oraz metod genetyki molekularnej; pozwalajš na coraz dokładniejsze mapowanie chromosomów człowieka. 105 VI. Badania c#togenet#czne w w#bran#ch grupach populac#jn#ch Krzysztof Boczkowsk„ Cyto#enetyka populacyjna - której celem jest okreœlenie i porównanie czgstoœci występowania zarówno aberracji liczbowych, jak i strukturalnych chromosomów w różnych grupach populacyjnyeh oraz przeœledzenie ich efektów fenotypowych - ma znaczenie zarówno dla genetyki ogólnej, jak i dla jej działów zajmujšcych się genetykš medycznš i klinicznš. BADANIA CYTOGENETYCZNE PŁODóW Z POI#ONIEl#T SAMOISTNYCH Badanie aberracji chrom#somalnych u płodów z poronień samoistnych pozw#la ocenić, jak duży proc#nt porunień jest spowodowany aberracjami chromosomalnymi i w zwišzku z tym niezależny od sposobu pro##adzenia cišży. W statystykach z różnych oœrodków, stosujšcych różne metody zapobiegania grożšcemu poroniemiu, proeent poronień jest podobny i niezależny od metod terapeutyc#ych. Wœkazuje to n# fakt, że właœnie czynniki genetyczne odgrywajš rolę w występowaniu takich poronień. Wystšpi#nie poronienia w takim przypadku zapabiega zwykle urodzeniu œię oœobnika z nieprawidłowym garniturem chromosomalnym. Wyniki badań garnituru chr#mosomalnego płodów z poronień samoistnych zostały po raz pierwszy zebrane i porównane przez Polaniego. Opracował on zestawienie na podstawie danych opublikowanych do 1966 r. obejmujšcych 261 poronień samoistnych, które nastšpiły w pierwszych trzech miesišcach eišży. Zestawienie wyników badań dokonane przez Polańiego (1966) pozwala na wycišgnięcie wstępnych wniosków. U 72 płodów (27o#o) stv,#erzono aberracje chromosomalne. Rodzaj stwierdzonych aberracji chromosomalnych oraz procent ich wystšpienża został podany w tab. 14. Niektóre aberracje chromasomalne wykryte w badaniach płodów ńie zostały stwierdznne u osobników żywych (noworodków) lub u osób dorosłych. 106 T a b e 1 a 14. Wyniki badań cytogenetycznych w 72 poronieniach samoistnych z aberracjami chronaosomalnyt#i (wg Polaniego) I#nteresujšce jest częste stwierdzanie nie spotykanej u osobników żywych trisomii chromosomów nr 16. Na uwagę zasługuje fakt, że jedynš aberracjš chromosomów płciowych był kariotyp 45,X; nie stwierdzono natomiast mozaiki 45,X/46,XX lub kariotypu 47,XXY, co dowodzi, że nie sš one letalne. Na uwagę zasługuje poró##-nanie stosunku aberracji autosomów do aberracji chromosomów płeiowych. Stosunek ten u plodów z poronień samoistnych wy#nosił 2:1 (w porównaniu z 1:1 u osobników żywych). Jest on jeszcze jednym dowodem na to, że aberracje autosomalne częœciej bywajš czynnikiem letalnym niż aberracje chromosomów płciowych. Niestwierdze-nie monosomii autosomów wskazuje najprawdopodobniej na to, że sš one letalne w bardzo wczesnym okresie zarodkowym (lub że nie dochodzi w ogóle do powstania zygot z b'rakiem jednego z autosomów). Badania płodów z poronień samoistnych dostarczyły materiału do porównania aberracji chromosomalnych oraz zmian morfologicznych. Pozwoliło to na okreœlenie czasu wystšpienia #ieprawidłowoœci w budowie płodu zależnych od nieprawidłowego garnituru chromosomalnego. Najobszerniejsze informacje, dotyczšce histologii gonad u płodów z kariotypem 45,X, podali Singh i Garr w 1966 r. Stwierdzili oni, że od trzeciego miesišca życia nie znajduje się różnicy vr budowie ganad pomiędzy płodami 45,X a 46,XX. W póŸniejszym ok#esie życia płodowego stwierdza się stosunkowo więcej tkanki łšcznej w gona,dach płodów 45,X. Szczególnie interesujšcy jest fakt, że zarówno u płodów 46,YX, jak i 45,X stwierdza się obecnoœć komórek pł„owych w gonadach. fiomórki te zanikajš jednak w pó„ziejszym okresie rozwoju u płodów 45,X. Nowsze publikacje podajš większš częstoœć występowania aberracji chromosomalnych u piodów z poronień samoistnych. Lauritsen, który wykonał badania cytogenetyczne 288 płodów z poronień samoistnych, u 55o/o stwierdził aberracje chromosomalne, przy czym częstoœć ta była jeszcze więl#sza wœród płodów z pierwszego trymestru cišży, gdyż wynosiła 6lo#o. Najobszerniejsze dane na temat wystepowania aberraeji chromosomalnych wœród płodów i noworodków podała Jacobs w 1977 r. Zestawiła ona dane z pięciu dużych badań. przeprowadzonych przez ró#nych autorów, które łšcznie o'ujęły prawie 2500 płodów z poronień samoistnych i były wykonane w 1970 r. lub w latach póŸniejszych. Badania te wykazały istnienie aberracji chromosomalnych u ponad 50o## badanych płodów. Ponad połowę aberracii chromosomalnych stanowiły trisomie, natomiast kariotyp 45,X stwierdzono w 20o#a przypadków. W ponad 20ojo przypadków stwierdzono istnienie poliploidii (triploidii lub tetraploidii), to znaczy 69 lub 92 chromosomów (ryc. 58). Pozostałe przypadki sta.nowiły aberracje strukturalne „lbo mozaiki z dwiema lub większš liczbš linii komórkowych (tab. 15). Typ aberracji jako % wszystkich badanych) #0? T a b e 1 a l:i. Aberracje chromnsomalne u płodów z poronień samoistnych, dane od roku 1970 (wg Jacobs) T a :; e 1 a 16. #berracje chroznosomalne u ##oeiń#t' z poz#ttień sa?:ro#;:nyctt nraz # no#i-orodlrów (wg Jacobs) Triso# ie I 4„,X Pło;ly 4,2 # l.i l#oworodki 0,29 # 0,01 Wsz#-s#kie cišże 4,49 # 1,51 TriSCTiE #y ĆbViliE c 7CSomC,,y' # #olz #,z / " , z,r #ro2# j L#"## '# #,X #, w ócY / 5 #01 # Tripioidia IiJ# 'E#-aaICiCliO ## ## l # RyC. 58. Rodzaje aberraCji Chromosomalnych u pYodów z poronień samoistiiyCh. AberraCie (o/a ciażv) Po i #,lo#4i# _ #truktu- # 3:z 4n r#lne ; I##I#e # i#"`##j## 1,## 0.~#i 0, C#.3 ; #a:i # 0,2 i t?";ł) 1,35 0,4# # 0,5 f t).3 # i \ T#isomiF i. # StrukturainE /gT‚wnie autosc.:mów Ryc. „9. Rodzaje abez-z-ae"i chromosotnaln#ch u noworodkó##:. Cieka##'ie przedstawia się porównanie aberracji chrom,so=z#alnych wystgpujšcych u płodów i L? noworodków (ryc. 58, 59, 60 i tab. IE}. W za:treœie tri-ů somii ani u płodów, ani u noworodków nie stwierdzono dodatkowego ctiromosomu nr 1 5 oraz 1 i, co wskazuje na to, że różna czestoœć #uystępu#: #ania poszezególnych trisomii nie jest przypadkowa. Najezęstszš trisomiš wvstępujšcš u plodów była trisomia ehromosomów nr 16, które" nie stwierdza się w ogóle wœród żywych noworodków, eo wskazuje na to, że jest letalna. 'Vatomiast trisomia nr 2!, która prowadzi do zPspołu Du##na,_ stanowi ponad 40o#o trisomii występujšcych u noworodków, a tylko 20#!## trisomii wvstepujšcych u płodów. Zdolnoœć przeżycia okresu płodowego jest więc dla tej trisomii stosunkowo duża; mimo to jednak można stwierdzie, że na każd#go żywego noworodka z zespolem Downa przypadajš trzy do czterech płodów z trisomiš nr 21, które zostały poronione. Aberracje liczbowe chromosomów płciowych które stanowiš ponad 50o#o dodatkowych chromosomów wy#tgpujšcych u noworodków, spotykane sš wyjštkowo rzadko wœród płudów z poronień samoistnych - dodatkowy chromosom X stwierdzono u ok. l##o #łi?dów, natomiast w żadnym przypadku nie stwierdzono obecnoœci dodatkowego chromosomu Y. Wskazuje to, że obecnoœć dodatkowego chrom#,#mu plciow ego nie jest w zasadzie cechš letalnš. "Oo;'" plodciw z aberracjami chromosomalnymi wykazuje kariotyp 45,X, lstóry wœród noworodków stwierdza się bardzo rzadko - 1 :10 000 żywo urodzonych. Pane te œwiadezš o tym, że większoœć te#o typ## przypadków :#i?e!08 ga samoistnemu poronieniu. Triploidie lub tetraplo„die, stanowišce raze#n ponad 20';# poronień samoistnych, nie były stwier„zane w ogóle wŒr”d bada= nych noworodków; wiadomo jest, że aberracje takie sš niezmiernie rzadkie wœr”d noWorodków i nawet jeœli nastšpi urodzenie żywego dzieeka, to cza# jego żyeia nie przekracza zwykle jednego roku. Dane pOwyższe pozwoliły również na wycišgnigcie wniOsku, że znacznie ponad 10#/o ludzkich zarodków lub płódów wykazuje aberracje chromosomalne, przy czym wEdlub niektórych autorów CzęStOŒĆ ta jEst duż0 WlgkSZa i wynosi ok. 30###. Co do częstOœci występowania poszezególnych typów aberracji chromosomalnych, to należy zauważyć, że najezęœciej stwierdzanymi trisomiami autosomów sš u płodów z poronień Samoistnych trisomie chrOmosomów nr # 7 - 10, 13 - 16, 18, 21, 22. Dla przykładu można podać; że trisomiE ChromosOnzów od 7 do 10 stwierdzono, każdš z nich, w killsunastu przypadkach; chromosomów nr 16 w 104 przypadkach, a chromosomów nr 21, 22 w 34 i 37 przypadkach (dane Jacobs oraz póŸniejsze). Natomiast nigdy nie stwierdzono trisomii chromosomów nr 1, 5 i 17. Rozpatrujšc te dane; należy jEdnak pamiętać o tym, że zależš one w dużym stopniu od tego, w jakim Oleresie trisomia danego chromosomu powoduje œrnierć płodu. Wiadom0 jest np.. żE trisomia nr 13 powOduje œmierć od wrzEsnego okresu żyeia płodowego aż do kilku lat po urodzeniu, natomiast letalny efekt trisomii nr 16 ujawnia si# w krótkim okresie pomiędzy 22 a 31 dniem życia płodowego, wlaœnie wtEdy, kiedy przeprowadza się Wię.kszoœć badań cytogenetycznych płodóW. Natomiast trisomie chromosOmów nr 1, 5 i 17 megš prowadzić. do œmierci W tak wezesnym okresiE zarodkowym, że nie uchwycono ich dOtychezas badaniem eytogenetycznym. Podsumowujšc powyższe dane, można przyjšć, że częstoœć występOWania aberraeji chromosomalnych u płodów z poronień samoiœtnych wynosi ponad 50#/a, przy czym u płodów z pierwszego trymestru cišży przekracza nawet 60ojó i prawdopodobnie jest jeszeze większa u płOdów poronionych w pierwszych tygodniach cišży. Wypływa z tego wniosek, że niektóre abErracje chromosOmalne sš letalne. a wystšpienie poronienia samoistnego zapobiega w wielu przypadkach urodzeniu się płodu z poważnš nieprawidłowoœciš chromosomalnš. BADANIA CYTOGENETYCZNE U NOWORODKÓW Badania eytogenetyczne noworodków majš ogromne znaczenie dla genetyki populacyjnej, gdyż pozwalajš okreœlić częstoœć występowania poSzezególnych aberracji chrOmosomalnych. JednoczeŒnie porównanie częstoœei występowania danej aberracji u płodów, noworodków oraz w populacji osób dorosłyc:i pozwala na Wycišgnięcie istotnyCh wniosków co do wpływu danej aberracji na zdolnoœć przeżycia. lV Tajobszerniejsze i najbardziej dokładne dane na ten temat opublikowali Hamerton i wsp. w 1975 r. Wykonali oni badanie cytogenetyczne leukocytów krwi obwodowej u 13939 noworOdków. Wyniki swoich badań zestawili z wynikami badań pięciu innych dużych ser, obejmujšc w ten sposób łšcznie 4G069 noworodków. Stwierdzili oni, że częstoœć występowania dużych zmian chromOsomalnych wynosi od 1:150 do 1:200 żywo urOdzonych noworodków. Gzęstoœć ta jest znacznie mniejsza od częstoœci występowania zmian chromosomalnych u wszystkich zarodków ż płodów, która wynosi ponad 10#!,#. Częstoœć poszezególnych aberracji chromosomalnych u nowo?-odk”w podan0 IO##a #na ryc. 60. Na podstawie powyżœzych danych można przyjšć, że u ak. 1:400 :noworodków występujš aberracje chromosomów płciowych; częœciej sš to no- worodki płci męskiej niż żeńsk„ej z powodu dużej częstoœci poronień wœród płodów 45,X. Około 1:500 noworodków m# aberrację strukturalnš autoso- mów, natomiast ok. 1:700 noworodków ma dodatkowy autosom w postaci trisomii (ryc. 59 i 60). Liczbowe Trisomia 13-1;'12CCC - 5,X -1/10000 chromosomów! 4#,XX# -1#1000 pTciowych / Liczbowe Trisomia 1B-1#75CC , 38'/o autosomów 47,XXY -1i 1000 30'/o Trisomia 21= 1j' 9B ##,k YY -1#1000 # # 5trukturalne (gTównie autosomów) 32'/o Ryc. 60. Bardziej dokładne dane dotyczšce rodzajów aberracji chromosomalnyeh występujšcych u noworodków. Oprócz monosomii 45,X w zasadzie wszystkie aberracje liczbowe chromosomów płciowych i autosomów - to tri;omie. Porównaj z ryc. 59. Zwraca uwagę wększa częstoœć występowania aberracji liczbowych chromosomów plciowych niż autosomów, pomimo że chromosomy płciowe sš tylko dwa, natomiast autosomów jest 44. Jest to najprawdopodobniej spowodowane tym, że wiele spoœród aberracji liczbowych autosomów prowadzi do poronienia. Natomiast wœród aberracji strukturalnych przeważajš u noworodków nieprawidłowoœci autosomów, gdyż aberracje te riie powodujš tak dużych zaburzeń w materiale genetycznym jak aberracje liczbowe i dlatego też ńie sš przyczynš tak dużej œmiertelnoœri. Wœród aberracji liczbowych chromosomów płciowych zwraca uwagę względna rzadkoœć kariotypu 45,X. Nie jest to jednak spowodowane tym, że aberracja ta występuje rzadżiej niż inne aberracje liczbowe chromosomów p#ciowych, lecz faktem, że płody z tš aberracjš sš często ronione, gdy-# ok. 20o/o płodów z poronień samoistnych wykazuje kariotyp 45,X (ryc. 58). Podobnie wœród aberracji autosomalnych, mniejsza częstoœć występowania trisomii nr 13 niż pozostałych trisomii jest prawdopodobnie zwišzana z faktem mniejszej 'zdolnoœci przeżycia tych płodów. #BADANIA CYTOGENETYCZNE U SIEDMIOI OSMIOLETNICH DZIECI #Badania cytogenetyczne objęły 4342 dzieci z populacji ogólnej w wieku 7 - 8 lat i były wykonane przez szeœć oœrodków cytogenetyczny#h w USA i opublikowane wspólnie w 1977 r. przez Patila i wsp. Wykazały one, że częstoœć #występowania aberracji chromosomalnych u badanych dzieci wynosi 1:200, wa więr ró#ni sdę tylko bardzo nieznacznie od częstoœci wy5tępowania aberracji chromosomalnych u noworodków. Wykazano natomiast, że wœród badanych dzieci stwderdza się, w porównaniu z noworodkami, mniejszš częstoœć występowania trisomii autosomalnych, co jest spowod4wane tym, że częœć 110 chorych z trisomiami autosomalnymi zmarła lub została oddana do zakładówspecjalnych. Częstoœć występowania aberracji strukturalnych autosomów była natomiast taka sama jak u noworo#ków. Przeprowadzone badania wykazały ponadto, że dużš częstoœć występowania aberracji chromosomalnyeh stwierdza się nie tylko wœród potomstwa matek starszych, lecz również wœród potomstwa matek bardzo młodych. Częstoœć występowania aberracji chromosomalnych u potomstwa matek poniżej 20 roku życia była podobna do tej, jakš stwierdza się u potomstwa matek w wieku 35 - 39 lat. Z przedstawionych danych wynika, że najmniejszš częstoœć występo#,ania aberracji chromosomalnych stwierdza się u potom= stwa matek będšcych ok. 25 roku życia, przy ezym dla populacji białej optymalny u#iek wynosi 25 - 27 lat, natomiast dla populacji czarnej 23 - 25 lat. Ponad 20o#o matek dzieci z de tz.ovo powstałymi aberracjami chromoso= malnymi poddano przeœwietleniu jamy brzusznej lub miednicy w roku poprzeclzajšcym zajœcie w cišżę, co wskazuje na znaczenie promieniowania w powstawaniu aberracji chromosomów w komórkach płciowych. Wskazuje również na to fakt, że wœród kobiet, które urodziły dziecko z aberracjš chromosomalnš, częœciej spotykało się osoby stykajšce się zawodowo z promieniowaniem, np. pracownice medyrzne. BADANIA CYTOGENETYCZNE U OSÓB NIE PRZYSTOSOWANYCH SPOŁECZNIE ORAZ U OSÓB UPO#LEDZONYCH UMYSŁOWO Najobszerniejsze dane na ten temat zostały opublikowane przez Smitha i Jacobs. Wœród pacjentów szpitali z maksymalnym nadzorem oraz wœród osólt. nie przystosowanych społecznie zwraca uwagę duża częstoœć występowania mężczyzn z kariotypem 47,XYY, a wżęc z obecnoœciš dwóch chromosomów płciowych Y. Dalsze badania wykazały, że mężczyŸni z kariotypem 47,XYY znajdujš się nie tylko w zakładach specjalnych lub więzieniach, lecz również w populacji ogólnej i że obecnoœć dwóch chromosomów płciowych Y nie musi prowadzić do antysocjalnego zachowania lub przestępstwa. Faktem jest #ednak, że obecnoœć kariotypu 47,XYY jest dużo częœciej spotykana wœród osób, które weszły w kolizję z prawem. Badazria prowadzone wœród osób nie przystosowanych społecznie wykazały, że najczęœciej stwierdzanymi aberracjami chromosomalnymi były nieprawidłowoœcń liczbowe chromosomów płciowych spowodowane obecnoœciš dodatkowego chromosomu płciowego, w postaci kariotypu 4.7,XYY lub 47,XXY. Wœród osób upoœledzonych umysławo najczęœciej stwierdzanš aberracjš chromosomalnš była trisomia 21 (zespół Downa). Doœć często występowały# również translokacje autosomalne. W z#kresie aberracji chromosomów płciowych u osób upoœledzonych umysłowo stwierdzano obok kariotypu 47,XXY lub 47,XXX komponent 48,XXXY lub 49,XXXXY występtxjšcy w postaci mozaiki. Mozaik„ takiej nie stwierdza się w populacji ogólnej, gdyż obecnoœćů ponad trzech chromosomów płciowych prowadai do poważnych zaburzeń, zarbwno w rozwoju psychicznym, jak i somatyeznym. Natomiast najczęœciej= występujšcš aberracjš strukturalnš - jest zespół łamliwego chromosomu X. II# POilSUMOWANIE ;gadania cytogenetyczne płodów i noworodków dostarczajš istotnych danyeh porównawczych, które pozwalajš okreœlić maczenie zmian chromosomalnych w zaburzeniach rozwojowych płodów. Częstoœe występowania aberracji chromosomalnych u płodów z poronień samoistnych przekracza 50o/o wœród płodów z poronień sztucznych wynosi ponad 2o/o. Natomiast ogólnš częstoœć występowania aberracji chromosomalnych u zarodków i płodów ocenia się na ponad 10o/o. Ta pozorna różnica pomiędzy 2a/o z poronień sztucznych a ogólnš liczbš ponad 10o/o tłumaczy się faktem, Ÿe płody z aberracjami chromosomalnymi sš ronione najczęœciej w pierwszych tygodniach cišży, a więc materiał z poronień sztucznych jest już matex~iałem, który nie obejmuje licznych poronień samoiœtnych, jakie miały miejsce we wczesnym okresie rozwoju. Częstoœć występowania aberracji chromosomalnych u noworadków wynosi 1:150, natomiast u siedmio- i oœmioletnich dzieci z populacji ogólnej wynosi 1:200. Badania prowadzone wœród osób nie przystosowanych społecznie wykazały, ie najczęœciej stwierdzanymi aberracjami chromosomalnymi były kariotypy 47,XYY lub 47.XXY. Wœród osób upoœledzonych umysłowo najczęœciej stwier#lzanš aberracjš chr4mosomalnš była trisomia 21 (zespół Downa). VII. Dziedziczenie jednogenowe Ja#ek Za#e#nba ODKBYCIA MENDLA Prawidła rzšdzšce dziedziczeniem uwarunkowanym obecnoœciš pojedynezych genów zostały odkryte i ogłoœzone przez Grzegorza Mendla w 1865 i 1866 r. Odezyt wygłoszony przez Mendla na posiedzeniu Towarzystwa Histor Naturalnej w Brnie (8 luty, 1865 r.) oraz publikacje z 1866 r. nie wywołały większego zainteresowania wœród współezesnych mu uczonych. Po prostu nie zdołali pojšć, a więc i docenić doniosłoœci obserwacji poczynionych przez Mendla. Dopiero po 34 latach przypomniano sobie o tym uczonym i ponownie "odkryto" jego prawa. Grzegorz Mendel, jak powszechnie wiadomo. badał groch i obserwował przekazywanie z pokolenia na pokolenie takich cech, jak barwa kwiatów, kształt nasienia itp. Czynišc te obserwaeje, sam zapewne nie zdawał sobie w pełni spr„,#vy z ich uniwersalnoœci w przyrodzie. Pierwsze prawo Mendla dotyczy segregacji genetycznej. Oparte jest na kilku wnioskach z wspomnianych wyżej obserwacji, a mianowicie: a) cechy dziedziczne uwarunkowane sš obecnoœciš jednostek dziedżiczenia - obecnie zwanych genami (Mendel posługiwał się terminem "czynnik"), b) geny sš przekazywane z pokolenia na pokolenie za poœrednictwem gamet, c) geny występujš w parach. Tę ostatniš koncepeję uznaE należy za szezególnie doniosłš. Parę homologicznych genów okreœla się obeenie jako allele. Sš one usytuowane symetrycznie w obrębie homologicznych chromosomów, a zajmowane przez nie miejsca okreœla się terminem locż (liczba pojedyneza - locus). Prawo segregacji w bardziej nowoczesnej wersji stwierdza, iż homologiczne geny (allele) u danego osobnika oddzielajš się jeden ad drugiego, tzn. segregujš, w trakcie tworzenia się gamet (jaj i plemników). Dzięki temu każda z gamet zawiera tylko po jednym z każdej pary genów. Obecnie, gdy znane sš mechanizmy podziału mejotycznego, prawo to wydaje się oczywiste. W czasach !Vlendla było to jednak odkrycie epokowe. Drugie prawo Mendla dotyczy niezależnego dżiedziczenia par alleli dwóch różnych genów. Osobnik podwójnie heterozygotyczny Aa i Bb wytwarza więc cztery możliwe typy gamet: AB, Ab, aB i ab. Loct. t2 (Aa i Bb) dziedziczš się zatem niezależnie. W œwietle nowszych danych, prawo to wymaga uzupełnienia i weryfikacji. Trzecie odkrycie Mendla dotyczy dominacji i recesywnoœci genów w odniesieniu do fenotypu. Według słów samego Mendla: "te cechy, które sš prze B - Zarys genetpki 113 kazywane w całoœci lub prawie niezmienione przez krzyżowanie (hybrydyzację), a więc stanowiš o cechaeh mieszańca (hybrydy), okreœla się jako dominujšce, zaœ te, które w tym procesie przechodzš w stan utajenia, jako "recesywne". Chodzi oczywiœcie o to, czy dane cechy ujawniajš się u heterozygot, czy tylko u homozygot. Pod pojęciem genu rozumiemy podstawowš jednostkę dziedziczenia równoznacznš z odcinkiem DNA zawierajšcym od kilkuset do kilku tysišcy par zasad'. Kolejnoœć (sekwencja) par zasad może być bardzo różna, dzięki czemu każdy gen cechuje się odrębnš budowš i zawiera swoistš informację. Funkcja poszczególnych genów polega na sprawowaniu kontroli nad syntezš różnych białek - enzymatycznych i strukturalnych. Dok3adne informacje na temat mechanizmów dziedziczenia na szczeblu molekularnym znajdzie Czytelnik w odpowiednim rozdziale (p. rozdz. II). Tu natomiast zajmiemy się praktycznymi aspektami dziedziczenia mendlowskiego w odniesieniu do genetyki klinicznej. Mendel czynišc swoje obserwacje, nie wiedział, że geny znajdujš się na chromosomach. Przypomnijmy tu, że para odpowiednich alleli usytuowana jest w tych samych miejscach na chromosomach odpowiedniej pary. Jeden z nich pochodzi od ojca, a drugi od matki. Dzieje się tak dzięki podziałowi mejotycznemu (p. rozdział II). Niezależne dziedziczenie cech uwarunkowanych pojedynczymi genami realizuje się w ten sposób, iż w podżiale mejotycznym każda para chromosomów dzieli się niezależnie. Tak więc podział pierwszej pary chromosomów jest niezależny od podziału pary drugiej itd. Konsekwencjš tej niezależnoœci podziałów poszczególnych par jest ogromna zmiennoœć gamet. Ponieważ w kariotypie człowieka występujš 23 pary chromosomów, a każda z nich dzieli się niezależnie, liezba powstajšcych z jednakowym prawdopodobieństwem typów gamet wynosi 2X2X2... =2#'=8 388 608. W rzeczywistoœci liczba możliwych wariantów gamet jest znacznie większa, ponieważ, jak pamiętamy z opisu podziału redukcyjnego, w trakcie mejozy dochodzi do wymiany homologicznych odcinków w obrębie poszczególnych par chromosomów. Dzięki podziałowi mejotycznemu poprzedzajšcemu zapłodnienie dochodzi więc nie tylko do redukcji liczby chromosomów o połowę (dzięki czemu liczba chromosomów w każdej komórce somatycznej w kolejnych pokoleniach pozostaje stała), lecz także do gruntownego "przetasowania" genów i chromosomów. DZIEDZICZENIE AUTOSOMALNE DOMINUJĽCE I RECESYWNE Prawa Mendla sprowadzajš się właœciwie do tego, iż znajšc genotypy obojga rodziców, można przewidzieć, jakie będš genotypy potomstwa i w jakich proporcjach będš one występować. Oczekiwane proporcje genotypów potomstwa można przedstawić graficznie za pomocš tzw. kwadratów Punnetta. Rycina 61 przedstawia dwa takie przykłacly. Zestawienie szeœciu możliwych kombinacji genotypów rodziców i oczekiwane proporcje genotypów potomstwa przedstawia tab. 17 i ryc. 61. Interpretujšc dane zawarte w tej tabeli, należy zwrócić uwagę na dwie istotne sprawy. Po pierwsze, proporcje podane w tabeli odnosić można wyłšcznie do genbw znajdujšcych się na autosomach. Dziedziezenie cech, których geny mie # Niektóre geny sš szczególnie duże, np. wielkoœć genu dystrofil mięœniowej Duchenn'a ocenia się na dwa miliony par zasad. 114 T a b e I a 17. Zestawienie 6możliwych kombinacji genotypów rodziców i oc%eki-wane proporeje genotypów wœród potomstwa w dziedziczeniu autosomalnym - do-minujšcym lub recesywny# Lp. Genotypy Proporcje genotypów w potomstwie rodziców AA Aa aa 1 AAXAA 1 0 0 2 AA x Aa 1/2 1/2 0 3 Aa x Aa 1/4 1/2 1/4 4 AA X aa 0 1 0 5 Aa x aa 0 1/2 1/2 6 aaxaa 0 0 1 #jCIeC Aa Gamety Matko aa 0 a Gomety Matka Aa b a Ryc. 61. Proporcje genotypów u potomstwa w dziedziczeniu autosomalnym przedstawione graficznie za pomocš kwadratów Punnetta (patrz kombinacja 3 i 5 w tab. 17). A - gen autosomalny dominujšcy, a - gen autosomalny recesywny. szczš się w obrębie chromosomów płciowych, #mówione jest oddzielnie (p. niżej). W ubu typach dziedziczenia autosomalnego płeć w zasadzie nie odgrywa roli. Po drugie, należy zaznaczyć, że geny dominujšce umownie omaczamy literš dużš (np. A), zaœ geny recesywne małš literš (np. a). W dziedziczeniu autosomalnym dominujšcym wystarczy obecnoœć (w genotypie) tylko jednego genu dominujšcego (A), ażeby dana cecha ujawniła się w fenotypie. Dla ujawnienia eechy autosomalnej recesywnej konieczna jest obecnoœć dwóch odpowiednich alleli recesywnych (aa). Znajšc te proste zależnoœci i dysponujšc zestawieniem podanym w tab. 17, możemy podać oczekiwane proporcje potomstwa dla obu typów dziedziczenia autosomalnego. Rycina 61 przedstawia tzw. wyidealizowane' schematy rodowodów dla wszystkich kombinacji występujšcych w tab. 17. Bioršc pod uwagę wspomniane wyżej prawidłowoœci dziedziczenia dominujšcego - przy kombinacjach 1, 2 i 4 całe potomstwo będzie wykazywać danš cechę dominujšcš - nie ' W rodowodzie "wyidealizowanym" proporcje potomstwa z okreœlonym genotypem odpowiadajš œciœle wartoœciom oczekiwanym, 115 zależnie od tego, czy będš to homozygoty AA, czy też heterozygoty Aa; przy kombinacjach 3 i 5 częœć potomstwa (o genotypie aa) nie będzie wykazywać danej cechy - odpowiednio 1/# i #/a, Zupełnie inaczej przedstawia się natomiast ujawnianie się eechy recesywnej uwarunkowanej występowaniem genu a w podwójnej dawce. Cecha taka ujawni się u częœci potomstwa - przy kombinacjach 3, 5 -- odpowiednio w i/4, w i/2 przypadków, zaœ przy kombinacji 6 u całego potomstwa. W badaniach genetyc#nych bardzo ważna jest analiza rodowodów oparta na szczegółowym wywiadzie i badaniu poszczególnych członków rodzin. W poszczególnych rodowodach rozkład osobników z cechš przekazywanš w sposób dominujšcy jest pionowy, ponieważ często cechę dominujšcš obserwuje się w kolejnych pokoleniach. Przy dziedziczeniu autosomalnym recesywnym spotyka się rozkład "poziomy" - występowanie danej cechy obserwuje się zazwyczaj tylko w jednym pokoleniu. W następnych pokoleniach dana cecha nie występuje - stšd nazwa cecha recesywna, tzn. "ustępujšca". Dzieje się tak dlatego, ponieważ szansa, że osobnik homozygotyczny aa wykazujšcy danš cechę napotka drugš osobę posiadajšcš ten sam, zazwyczaj rzadko występujšcy gen recesywny a, jest nieduża. Małżeństwo z osobš o genotypie AA może dać tylko zdrowe potomstwo heterozygotyczne Aa (patrz kombinacja 4 w tabeli). Spokrewnienie rodziców wydatnie zwiększa szansę wystšpienia danej cechy, ponieważ oboje mogš być nosicielami tego samego genu odziedziczonego od wspólnego przodka. Zagadnienie to zostało omówione w rozdziałach XI i XIV. Wspomnijmy tu więc tylko, że częstoœć małżeństw spokrewnionych w populacji ludzkiej nie jest duża: w Europie i Ameryce częstoœć małżeńœtw pomiędzy kuzynami I stopnia wynosi 0,01. W Japonii małżeństwa takie spotyka się szeœciokrotnie częœciej (0,06). Znajduje to swój wyraz w częstszym występowaniu wielu chorób recesywnych autosomalnych w populacji japońskiej. Wœród rodziców dzieci dotkniętych rzadkimi chorobami o tym typie dziedziczenia obserwuje się szezególnie duży odsetek małżeństw spokrewnionych (tab. 18). Dane przedstawione w tabeli 18 wykazujš, że po pierwsze, wœród rodziców dzieci z rzadkimi chorobami recesywnymi autosomalnymi odsetek małżeństw pomiędzy kuzynami I stopnia jest znacznie większy niż w populacji T a b e 1 a 18. Odsetek małżeństw spokrewnionycb - pomiędzy kuzynami I stopnia wœród rodziców dzieci dotkniętych rzadkimi chorobami recesywnymi autosomalnymi Nazwa ehoroby Częstoœć małżeństw między kuzynami I stopnia wœród rodziców dzieci chorych w % Stany Zjednnczone (1%) Japonia (6%) Œlepota na barwy, pelna (a.chro#n.atopsia) Albinizm 20 4g Xeroder#m,a pigmentosum Rybia luska wrodzona Choroba Taya-Sachsa gg Przy nazwach państw podano odsetki malżeństw pomiędzy kuzynami I stopnia (dane wg Hartla). 116 ogólnej, a po drugie, że częstoœć małżeństw spokrewnionych wœród rodziców dżieci dotkniętych rzadkimi chorobami autosomalnymi recesywnymi jest tym większa, im większa jest częstoœć takich małżeństw w populacji ogólnej. Badania prowadzone na zwierzętach doœwiadezalnych wskazujš dobitnie że chów wsobny wpływa w znacznym stopniu na ujawnianie się chorób re- cesywnych autosomalnych. Na przykład wg Rodricka (1977 r.) liczba znanych chorób autosomalnych recesywnych u hodowanych wsobnie myszy jest wy- raŸnie większa aniżeli liczba ehorób dominujšcych: odpowiednio 222 (63o/o) i 194 (37 /o). W populacji ludzkiej odpowiednie wartoœci przedstawiajš się na- (70 % j #Wg c Moroby recesywne autosomalne 626 (30#/a), a dominujšce 1442 cKusicka, 1988). Stšd można wnosić, że w genomie człowieka znajduje się jeszeze dużo dotychezas nie ujawnionych i nie zidentyfikowa- nych genów chorób recesywnych autosomalnych. Chorób genetycznie uwarunkowanych jest więc bardzo wiele, ale na szezę- œcie większoœć z nich występuje rżadko, ponieważ mała jest częstoœć warun- kujšcych je genów. Stšd prawdopodobieństwo wystšpienia u obojga rodziców #enu tej samej rzadkiej choroby jest bardzo niewielkie. Częstoœć genu mu- kowiscydozy (zwłóknienia torbielowatego trzustki) - najezęstszej spoœród chorób recesywnych autosomalnych - wynosi 1:50. Co dwudziesta pišta osoba jest zatem zdrowym noœicielem lub nosicielkš tego genu *. Prawdopo- dobieństwo spotkania się w małżeństwie dwóch osób majšcych ten sam gen mukowiscydozy wynosi więc 1:25xl:25=1:625, a częstoœć występowan:a cho- roby wynosi odpowiednio 1:50x1:50=1:2500. #^. AA AA AA AA I: A A :1 Aa ##;, AA AO 3 # AA # # ##a aa #`A aa 4 Aa Aa Aa Aa 5 #a Ao A" a#. # o#=cb#;k ptci mg5kie# D.#5 żeński.,j a ao 6 ca ca aa #; , ń :=:yc. 62. Sehematy rodowodbw -,vvyidealizowane" - w dziedziczeniu autosort:;zlnyzn: dominujšcym i recesywnym (porównaj z danymi w tab. 17). Mała częstoœć patologicznych genów w populacji ogólnej sprawia, iż tylko niektóre z 6 rozważanych wyżej kombinacji genotypowych (tab. 17 i ryc. 62) sš praktycznie ważne. W odniesieniu do chorób autosomalnych dominujšcych jest to kombinacja 5: oczekiwana proporeja osób chorych - równoznaczna z ryzykiem zachorowania - wynosi i/2 (patrz także ryc. 63a). * Częstoœć genu podaje się w przeliczeniu na liczbę chromosomów, która jest oczywiœcie dwukrotnie większa od liczby osób w danej populacji. 117 #c ao Aa Ža Ryc. B3. Najbardziej charakterystyczne ů kombinacje genotypów rodzicielskich av dziedziczeniu chorób autosomalnych domi-u# Aa Ao aa AA ,qo p,o # nujšcych (a) i autosomalnych recesywnych (b). W dziedziczeniu dominujšcym gen chorobowy oznaczony jest literš A; w a b dziedziczeniu recesywnym literš a. # osobnik zdrowy # osobnik chory fl żdrowy nosiciel recesywnego autosomolnego genu chorob# W odniesieniu do chorób autosomalnych recesywnych natomiast najważniejsza jest kombinacja 3, w której oboje heterozygotyczni rodzice sš zdrowymi nosicielami genu chorobowego a. Ryzyko urodzenia się dziecka chorego#omozygoty aa wynosi w tym wypadku 1/#; s/# potomstwa jest zaœ zdrowe: '/a stanowiš homozygoty AA i '/: zdrowe heterozygoty Aa (p. także ryc. 63b). Proporeja genetyczna dla cech uwarunkowanych autosomalnie dominujšco wynosi więc 1:2, a dla cech uwarunkowanych autosomalnie recesywnie 1:4. Ocaywiœcie, możliwe, lecz dużo mniej prawdopodobne jest napotkanie innych spoœród 6 wymienionyeh kombinacji genotypów rodzicielskich. W chorobach dominujšcych możliwa, choć bardzo rzadka, jest kombinacja 3, gdy oboje heterozygotyczni małżonkowie dotknięci sš tš samš chorobš. 7#nane sš np. wypadki zawierania małżeństw przez osoby dotknięte aehondroplazjš *. Ryzyko wystšpienia choroby u potomstwa wynosi wówezas teoretycznie 3:4. Istniejš jednak dane, pozwalajšce sšdzić, że homozygoty AA - majšce gen achondroplazji w podwójnej dawce - nie sš zdolne do życia. Prawdopodobieństwo urodzenia dotkniętego achondroplazjš i zdolnego do życia dziecka wynosi więc w takim wypadku nie 3 :4, lecz 2 :3. W chorobach reeesywnych autosomalnych niekiedy - choć bardzo rzadko - możemy mieć do czynienia z kombinacjš 5, gdy partnerem lub partnerkš dotkniętej chorobš homozygoty aa jest osoba majšca gen patologicz 'i ;1 b e : a 19. Przvkładv chorób dominujšcych autosomalnych Nazwa choroby Lokalizacja genu na chromosomie Achondroplazja Stwardnienie guzowate (selerosfs tuberosa) NerwiakowlókniakowatoœE (choroba Recklinghausena) Choroba Crouzona (dysostosfs cra#t.i.ofacżalis) Hipereholesterolemia rodzinna Porfiria ostra przerywana Dystrofia miotoniczna Steinerta Plšsawica Huntingtona Choroba Charcota, Marie i Tootha (jedna z postaci choraby) Siatkówezak plodowy Torbielowatoœć nerek, postać dorosłych Zespół paznokciowo-rzepkowy Choroba afektywna (psychoza maniakalno-depresyjna) 9q11 - q22 l7cen - q22 19p13.2 - p 13.1 llq23.2 - qter l9cen - q12 4p16.3 Ip22 - q23 13#14.1 16p13.31 - p13.12 9q34 llpl5.5 * Karłowaty wzrost w zwišzku z zaburzeniem rozwoju chrzšstek - choroba dziedziczšca się w sposób dominujšcy. 118 T a 5 e 1 a 20. Przykłady chorób recesywnyeh autosomalnych Nazwa choroby Lokalizacja genu na chromosomie Jaskra wrodzona (glaucoma) Maloglowie prawdziwe (microcephal%a veru) Galaktozemia Fukozydoza Mukopolisacharydoza I (choroba Hurler) Mannozydoza Gangliozydoza GMz (choroba Taya i Sachsa) Leukodystrofia metachromatyczna Fenyloketonuria Glikogenoza II (choroba Pompego) Choroba Wilsona (zwyrodnienie wštrobowo-soczewkowe) Mukowiscydoza ehromosom 11 lq31 - q32.l 9p13 lp34 22q11 19p13.2 - q13.2 15q22 - q25.1 22q13.31 - qter 12q24.l 17q23 13q14 7q23.3 - q23.1 ny w pojedynczej dawce (heterozygota Aa). W takim wypadku ryzyko wystšpienia choroby wynosi nie 1:4, lecz 1:2, a więc jest charakterystyczne dla chorób dominujšcych. Możliwa, lecz również rzadka jest kombinacja 6, gdy parę małżeńskš tworzš osoby dotknięte tš samš chorobš recesywnš (homozygoty aa). W takim wypadku ryzyko urodzenia chorego, homozygotycznego dziecka wynosi oczywiœcie 1, tzn. l00o/o. Do małżeństw takich dochodzi np. pomiędzy osobami głuchoniemymi, głuchoniemota wrodzona w większoœci przypadków dziedziczy się bowiem w sposób recesywny autosomalny. Przykłady chorób autosomalnych - dominujšcych i recesyw#nych podano w tab. 19 i 20. DZIEDZICZENIE SPRZ#ŻONE Z PŁCIĽ Sprzężenie z płciš jest rozumiane na ogół jako równoznaczne z usytuowaniem danego genu na chromosomie X. Dlatego alternatywnie używa się terminu "sprzężenie z chromosomem X". W istocie "sprzężenie z płciš" jest terminem szerszym, ponieważ może obejmować również sprzężenie z chromosomem Y; na chromosomie tym zidentyfikowano jednak dotšd tylko kilka genów, w tym gen okreœlajšcy różnicowanie się jšder TDF (testis determining factor), znajdujšcy się w ramieniu krótkim (p) chromosomu Y. Szansa ujawnienia się cechy recesywnej sprzężonej z chromosomem X różni się w zależnoœei od płci (p. ryc. 64). Kobieta ma dwa chromosomy Xmoże być zatem w odniesieniu do danego genu sprzężonego z płciš heterozygotš lub homozygotš. Ujawnienie się cechy sprzężonej z płciš u kobiety podlega więc takim samym prawom jak przy dziedziezeniu autosomalnym: dla ujawnienia się cechy recesywnej konieczne jest wystšpienie genu w podwójnej dawce (aa); dla ujawnienia się cechy dominujšcej wystarczy obecnoœć genu A na #ednym z pary chromosomów X. U mężczyzny, który ma przecież tylko jeden chromosom X, dla ujawnienia się danej cechy wystarczy obecnoœć jednego genu recesywnego (a) usytuowanego na tym chromosomie; w odniesieniu do genów sprzężonych z chromosomem X mężczyzna jest nie hetero-, lecz hemizygotš. Zestawienie B możliwych kombinacji genotypów rodziców i oczekiwane proporcje genotypów u ich potomstwa w dziedziczeniu recesywnym sprzężonym z chromosomem X przedstawia tab. 21. 119 r, A 4- A = 4A A# áA Aa 4 2) A# a - 4 # A a- Aa oA A Ac A# Aa aa 0- r'::#,. p%c#i rn#skie; r; #:; i'#. #T:#! ::2il5ki8) ## #`.#rll# Zjra\^ly# ~ ;:k cho#y O : ::-icielkc!.-,#i .3i Aa 4a a-- r. aa o a0 0- 00 a #.yc. 64. "Wyidealizowane" rodowody w dziedziczeniu recesywnym sprzężonym z płciš (porównaj z danyxxii w tab. 21). T a b e I a 21. Dziedziczenie recesywne sprzężone z chromosomem X: 6 możliwych kombinaeji genotypów rodzieów i oczekin#ane proporcje genotypów ai ich potemstwa 6#' zależnoœci ed płci (porówn2j z rye. E#) Lp. Matka Ojciec Córki Synowie (XX) (XY) AA Aa aa A- # a1 AAx A- 1!2 1/2 - 2 AaXA- 1/4 li4 1/4 1/4 1 2 1 /2 3 aa xA- I - / 4 AA x a- - 1/2 - Il2 - „ Aaxa-- 1/4 1!2 - 1/2 6 ' aax a- 1/2 - 1 !2 Praktycznie najważniejsza, bo najczęœciej spotykana, jest kombinacja 2. w której kobieta - zdrowa nosicielka przekazuje gen połowi# swego potumstwa: połowie córek, które - tak jak ich matka - stajš się nosicielkami genu i połowie synów, u których dana eecha (choroba) ujawnia się. Ryzyko wystšpienia choroby u potomstwa płci męskiej wynosi wigc w tyxn wypadku i;', (p. także ryc. 65a). Ważna jest także kombinacja 4: jak widać, całe potomstwo chorego ojca jest zdrowe, z tym że wszystkie córki stajš się nosicielkami genu chorobowego a (rye. 65b). Występowanie chorób przekazywanych w sposób recesywny sprzgżuny z płciš u l#o#iet należy do rzadkoœci. V4'ynika to z przedstawionych wvżej prawideł 120 # ' XA '#u;k;c r Xa Netko 6 xA Ryc. 65. Proporeje genetyczne u potomstwa w dziedziczeniu recesywnym sprzężonym z płciš przedstawione graficznie za pomocš kwadratów Punnetta (porównaj kombinacje 2 i 4 w tab. 21). Dla podkreœlenia, iż mamy do czynienia z dziedziczeniem sprzężonym z płciš, zaznaczono pary chromosomów matki - XX i ojcaXY ; a - recesywny gen chorobowy 5a : matka zdrowa nosicielka g#nu chorobowego a - choruje połowa potomstwa płci męskiej: połowa potomstwa płeż żeńskiej to zdrowe nosicielki genu a. b: ojciec chory - całe potomstwo jest zdrowe; #vszystkie dziewezęta sš nosicielkami genu chorobowego a. rzšdzšcych tym typem dziedziezenia. Jeżeli np. dana cecha uwarunkowana w taki właœnie sposób u mężezyzn występuje z częstoœciš I:10, to prawdopodobieństwo jej wystšpienia u kobiety jest tylko dziesięciokrotnie mniejsze 1/10 =1/100. Przy częstoœci cechy 1:100 u mężezyzny prawdopodobieńœtwo wyœtšpienia jej u kobiety jest już œtukrotnie mniejsze, tzn. 1:10000, a dla częstoœci 1:1000 - tysišckrotnie mniejsze, tzn. 1:1000 000. Choroby recesywne sprzężone z płciš wyœtępujš bardzo rzadko. Jednš z najczęstszych spoœród nich jest dystrofia mxęœniowa Duchenne'a, która u chłopeów występuje z częstoœciš 1:3000; jest więc zrozumiałe, że przypadki zachorowania wœród dziewezšt œpotyka się wyjštkowo. W innych na ogół znacznie rzadziej występujšcych chorobach recesywnych sprzężonych z płciš prawdopodobieństwo zachorowania kobiet jest tak znikome, że praktycznie można je pominšć. Zatem dla rodowodu, w k;tórym występuje choroba recesywna sprzężona z płciš, charakterystycane jest, iż chorujš tylko synowie, a w zwišzku z tym, że gen choroby przekazywany jest przez kobiety - cz#sto także T a b e 1a 22. Przykłady ehoró# sprzężons ch z c#romnsomem X Lp.Nazwa choroby Lokalizacja genu na chromosomie X 1 Dystrofia mięœniowa Duchenne'a Xp22.1 2 Dystrofia mięœniowa Beckera Xp22.1 3 Dystrofia mięœniowa Emezy'ego i Dreifussa Xq28 4 Zespół jšder feminizujšcych Xpll - qll 5 Choroba Charcota,Marie i Tootha XqI3- q21 E liemofilia A. Xq28 9 Hemofilia B Xq27.1- q27.2 8 Zespół Leseha i Nyhana Xq26- q27.2 9 Nlukopolisacharydoza II (choroba Huntera) Xq26- q2# 10 $lepota na barwy (daltonizm) Xq28 11 Zespół łamliu,ego chromosomu X (Fra X) Xq27.31 12 Hipofosfatemia dziedziezna Xp22 121 bracia matki (a czasem i jej ojciec) dotknięci sš chor#bš (patrz także rozdział Analiza rodowodów). Znane jest także dziedziczenie dominujšce sprzężone z płciš - choć chorób w taki sposób uwarunkowanych jest niewiele. W tym typie dziedziczenia kobiety chorujš dwukrotnie częœciej niż mężczyŸni, ponieważ majš dwukrotnie więcej chromosomów X. Chora, heterozygotyczna kobieta przekazuje chorobę połowie swego potomstwa - niezależnie od płci. Chory mężczyzna przekazuje chorobę wszystkim swoim eórkom i żadnemu ze swych synów. Przykładem cechy fizjologicznej przekazywanej w ten sposób jest grupa krwi Xg (a -ł-). Przykłady chorób sprzężonych z chromosomem X podano w tab. 22. Na 12 chorób podanych w tab. 22, 11 dziedziczy się w sposób recesywny sprzężony z płciš, a tylko jedna (pozycja 12) w sp#sób dominujšcy sprzężony z płciš. Zespól łamliwego chromosomu X charakteryzujšcy się obecnoœciš chromosomu X markera - z przewężeniem w miejscu odpowiadajšcym w przybliżeniu pozycji genu, tzn. Xq27.31 - również częœciowo spełnia kryteria dziedzicz#nia dominujšcego sprzężonego z płciš, ponieważ częœć kobiet - heterozygot dotknięta jest upoœledzeniem umysłowym* - chociaż z reguły lżejszego stopnia niż chorzy mężczyŸni. WYBRANE ZAGADNIENIA DOTYCZĽCE DZIEDZICZENIA JEDNOGENOWEGO PROPORCJA GENETYCZNA - SPOS6B U#PALNIANIA SI# OD áL#DU SELEKCJI W tłumaczeniu prawideł dziedziczenia jednogenowego posługiwaliœmy się dotšd tzw. wyidealizowanymi rodowodami, w których proporcja osób zdrowych odpowiadała œciœle wartoœci oczekiwanej. Oczywiœcie, w praktyce mamy do czynienia z sytuacjš zupełnie innš: oczekiwana proporcja sprawdza się tylko w stosunkowo niewielkiej liczbie rodzeństw. W wypadku roœlin i zwierzšt doœwiadczalnych, takich jak groszek czy muszka owůocowa, problem taki nie istnieje, ponieważ dysponujemy dostatecznie dużš liczbš potomstwa i możemy ograniczyć się do liczenia osobników o takim lub innym fenotypietak np. jak to czynił Mendel w swoich doœwiadczeniach z grochem. U człowieka stajemy przed dużo trudniejszym zadaniem, liczebnoœć potomstwa z poszczególnych par rodzicielskich jest bowiem bardzo znikoma - rzadko powyżej 4. Nie możemy zatem oczekiwać, żeby typowe dla różnych typów dziedziczenia proporcje sprawdzały się w poszczególnych rod2eństwach. Wyjœciem z sytuacji jest zebranie większej liczby rodzin i badanie proporcji genetycznych w skomasowanym materiale. Tu jednak narażeni jesteœmy na popełnienie błędu selekcji, a to z następujšcych przyczyn: Po pierwsze, trafiajš do nas wytšcznie takie rodziny, w których wystšpiły przypadki choroby, a rodziny, w których przypadki takie nie wystšpiły, wypadaja nam z pola widzenia. Dla przykładu: nie ma w tym nic dziwnego, że w wielu wypadkach rodzice, zdrowi nosiciele cech recesywnych autosomalnych Aa X Aa, majš wy#šcznie zdrowe dzieci; szansa urodzenia z takich par rodzicielskich dziecka zdrowego wynosi 75o/o, a więc przy odrobinie szczęœcia ' Zespól łamliwego chromosomu X jest, po zespole Downa, drugš pod względem częstoœd występowania; znanš przyczynš upoœledzenia umyslowego glębszego stopnla. 122 osoby takie mogš mieć wyłšcznie zdrowe dzieci i nigdy nie dowiedzieć sig o potencjalnym zagrożeniu. Po drugie, zrozumiałe jest, że rodziny z większš liczbš potomstwa chorego majš większš szansę trafienia do naszych poradni aniżeli rodziny, w których wystšpiły tylko pojedyncze przypadki choroby. Przyjmuje się, że prawdopodobieństwo natrafienia przez nas na rodzeństwa z dwoma lub trzema osobami chorymi jest odpowiednio 2 lub 3 razy większe niż prawdopodobieństwo natrafienia na rodzeństwo z jednš osobš chorš. T a b e 1 a 23. Rozkład 256 czteroosobowych rodzeństw w zależnoœci od liczby chorycb homozygot aa # Typ rodzeństwa Oczekiwana lic#l#a 81 108 31,6 42,2 54 12 21,1 4,9 1 0,4 Łšcznie 256 100,0 ' Wartoœci podane w tabeli otrzymano w wyniku rozwinięcia wyrażenia (3/4-#-#1/4)4, w którym 3/4 stanowiš osoby zdrawe o genotypie Aa i AA lšcznie, a I/4 osoby chore o genotypie aa. Tabela 23 przedstawia rzeczywisty rozkład czteroosobowych rodzeństw w zależnoœci od liczby osób dotkniętych chorobš recesywnš autosomalnš (gen#typ aa; genotyp rodziców we wszystkich przypadkach Aa X Aa). Jak wynika z wartoœci podanych w tej tabeli, można oczekiwać, że tylko 42a/o rodzeństw czteroosobowych będzie wykazywać typowš dla dziedziczenia recesywnego autosomalnego proporcję osób chorych. W blisko 32#/o rodzeństw przypadki choroby w ogóle nie wystšpiš. Spróbujmy teraz na przykladzie pokazać, w jaki sposób można uwolnić się od popełnienia błędu selekcji przy obliezaniu proporcj i genetycznej. Ryc. e6. Sposób uwalniania się od blędn selekcji w oblIczaniu pr^mporćji genetycznej (opis w tekœcie). Oaa # laa # 2aa # 3aa # 4aa l I3 PrzypuœEmy, że trafiła do nas pewna liczba trzyosobowych rodzeństw z różnš liczbš dzieci dotkniętych jednš z chorób podejrzanych o genetyczne uwarunkowanie (ryc. 66a i 66b). Jak przedstawiono na ryc. 66, w materiale naszym znalazło się 16 rodzeństw, w których, na globalnš licżbę 48 członków rodzeństw, odnotowano łšczrzie 24 przypadki choroby, tzn. '/r. Jest to proporcja, której można byłoby oczekiwać przy autosomalnym dominujšcym typie dziedziczenia. Zdajemy sobie jednak sprawę z tego, iż z podanych wyżej powodów materiał, którym dysponujemy, musi byE obcišżony poważnym błę#em selekeji. Jednym ze skutecznych sposobów uwolnienia się od tego błędu jest pominięcie w każdym rodzeństwie jednej chorej osoby (ryc. 66b). Uzys?rujemy w ten sposób wartoœci s/#Q = 1/4, która odpowiada proporcji typowej dla dziedziczenia recesywnego autosomalnego. 1Va takim właœnie podejœciu oparta jest jedna z metod obliczania proporcji genetycznej opracowana przez Weinberga, w której stosuje się wzór: R-N T-N gdzie: p oznacza proporcję genetycznš, R - liczbę osób chorych, #Tliczbę wszystkich członków rodzeństw łšcznie, N - liczbę rodzeństw. Podstawiajac nasze wartoœcl do powyższego wzoru otrzymujemy: 24-16 8 1 48 -16 32 4 Znamy oczywiœ„e wiele meto„ obliczania proporcji genetycznej, które stosujemy w zależnoœci od rodzaju materiału, którym dysponujemy, a œciœlej: od sposobu, za pomocš którego materiał nasz został zarejestrowany. Dalsze rozwijanie tego tematu wykracza jednak poza tematykę tego rozdziału. KO#lOMFNACJA iiodominaeja istnieje wówczas, gdy w jednym Locus może znajdować się więcej zziż jeden allel dominujšcy. Sytuacja taka ma miejsce np. w wypadku grupy krwi ABO (locus ABO znajduje się na chromosomie 9q34). Odpowiednie allele można oznaczyć A, B i 0. Osoby o genotypie AA lub AO majš grupę krwi A, osoby o genotypie BB lub á0 majš grupę krwi á, genotyp 00 odpowiada grupie 0; wreszcie istnieje genotyp i grupa AB. Ta# więc zarówno geny A, jak B sš domin#.xjšce w stosunku do genu 0. Geny A i á w stosunku do siebie sš zaœ kodominujšce. W istocie sprawa jest nieco bardziej złożona, ponieważ mogš występować dwie odmiany genotypu A: As i A#. Warianty genotypów miejsca genowego ABO można przedstawić w postaci trbjkšta (ryc. 67). PodAB AO BO :`= A Ryc. 67. #Varianty fenotypów miejsca genowego grup krwi AB0. Fenotyp AB (wierzchołek trójkšta) œwiadczy o kodominacji. 12# #amety #,r; Ojciec BO .#am#!# ' A P#atka AA b A Ojciec BB B g Ryc. 68. (a) Genotypy potomstwa AO i BO œwiadczš o dominacji genów A i B w stosunku do genu 0ů gen recesywny 0 ujawnia się tylkn w postaci homozygotycznej, natomiast genotyp AB œwiadczy o kodominacji: w fenotypie ujawniajš się oba ge- ny A i B. (b) Jeœli rodzice sš homozygotami AA i BB, to oba geny A i B ujaw- niajš się u całego p#tomstwa. stawę trójkšta stanowiš trzy genotypy homo#ygotyczne, reszta genotypów to heterozygoty, przy czym genotyp AB (wierzchołek trójkšta) stanowi przykład kodominacji. Rycina 68 przedstawia dwa przykłady segregaeji genotypów rodzicielskich pozwalajšce na przeœledzenie kodominacji genów A i B. Kodominujšce sš także geny grupy krwi M i N, których locus znajduje się na ehromosomie 4q28 - q31. Przyklad obliczania częstoœci tych genów w populacji o#ólnej znajdzie Czytelnik w rozdziale XI - Genetyka populacyjna. MUTACJE Zagadnienie to w różnych aspektach zostało omówione w rozdziałach IX i XI. W tra#ycyjnym ujęciu mutacja jest zmianš zachodzšcš w obrębie materialu genetycznego DNA, w znacznej większoœci przypadkóv# stabilnš, która może być przekazywana z pokolenia na pokolenie; sposoby przekazywania zostaty omówione powyżej. Mutacja może dotyczyć różnych poziomów organizacji materiału genetycznego - poczšwszy od grubych zmian dotyczšcych ehromosomów, jak różne typy aneuploidii - aż do drobnych zmian na s#rzeblu molekularnym. Rozdział ten poœwięcony jest dziedziczeniu jednogenowemu, dlatego też mutacje, o których jest tu mowa, dotyczš zmian zachodzšcych w obrębie pojedynczych genów. Charakter mutacji na srczeblu molekularnym rozpoznaje siQ bšdŸ poœrednio - za pomocš badania produktów bialkowych poszczególnych genów lub mRNA' bšdŸ bezpoœrednio, dokonujšc analizy samego DNA. Mutacje na paziomie DNA można podzielić na dwie zasadnirze kategorie: a) mutaeje punktowe polegajšce na podstnwieniu (substytucji) jednego nukleotydu w miejsce drugiego, ' m - messenger RNA czyli RNA informacyjn# - powstaje nn matrycy DNA w procesie transkrypcji, a następnie po przejœciu do eytoplazm# sam tnrorzy matrycę (w obrębie rybosomów), na htbrej syntetyzuje się odpawiedni rodznj bia#kn (procrs zwany translncjš). 125 b) mutacje zwišzane ze zmianš długoœci nici DNA (length mutations) polegajšce na delecji (ubytku) lub addycji, czyli wstawieniu nowego odcinka DNA; ubytek bšdŸ nadmiar materiału genetycznego może dotyczyć od jednego do wielu tysięcy nukleotydów. Mutacja punktowa może bye wywołana zmianami zarówno sekwencji niekodujšcych - intronów, jak i sekwencji kodujšcych - egzonów. Zmiana dotyczšca tylko jednego nukleotydu może powodować: a) mutacje zmiany sensu (missense mutation) - gdy zmiana jednej zasady w kodonie powoduje zastšpienie w białku jednego aminokwasu przez drugi, b) mutacje nonsensowne polegajšce na zastšpieniu kodonu sensownego, oznaczajšcego okreœlony aminokwas, przez kodon nonsensowny, równoznaczny z sygnałem,stop", oznaczajšcym terminację procesu translacji. Mutacje zmiany sensu powodujš zmianę właœciwoœci biologicznych białka. Mutaeje nonsensowne - zazwyczaj znoszš całkowicie funkcję danego białka. Mutacje punktowe mogš zabuizać procesy transkrypcji, np. poprzez zmianę w obrębie promotora, czyli sekwencji DNA, w którym zostaje zapoczštkowana transkrypcj a. Zmiana pojedynczego nukleotydu może także zaburzać proces cięcia i składania (splicing), a więc obróbki mRNA. Wynikiem tego jest powstanie nieprawidłowego mRNA, który nie może ulec translacji (przełożeniu) na prawidłowe białko. Delecje lub duplikacje mogš być vc,ywołane zaburzeniami podczas koniugacji, np. koniugacjš nieh.omologicznych odcinków chromosomów bšdŸ nierównš wymianš (crossing over) materiału genetycznego. Delecje stanowiš prawdopodobnie od 5 do 15"/o znanych mutacji, przy czym w niektórych chorobach genetycznych proporcja ta jest szczególnie duża, np. już obecnie wiadomo, że w dystrofii mięœniowej Duchenne'a przynajmniej w 70o/o przypadków mechanizm mutacji polega na delecji. Bliższe dane na temat mutacji na szczeblu molekularnym znajdzie Czytelnik w specjalnych opracowaniach poœwięconych tym zagadnieniom. Dziedziczne mutacje powstajš w komórkach rozrodczych męskich lub żeńskich w okresie poprzedzajšcym gametogenezę lub w czasie gametogenezy - w różnych jej stadiach. Wspomnieć należy, że mutacje mogš dotyczyć materiału genetyeznego także w komórkach somatycznych, te ostatnie nie sš jednak dziedziczone. Należy zdawać sobie sprawę, że mutaeje były i sš Ÿródłem całej zmiennoœci genetycznej: nowe allele powstajš tylko przez mutacje, nie ulega więc wštpliwoœci, że obok innych czynników omówionych w rozdziale XI - sš one jednym z zasadniezych czynników ewolucji gatunków. Jcst to ogromnie szerokie zagadnienie obejmujšce bardzo wiele aspektów. Istniejš mutacje nieszkodliwe - oboję#ne lub pozytywne, oraz szkodliwc - negatywne. Tymi ostatnimi zajmuje się w głównej Fnierze genetyka kliniczna. przy czym pojęcie szkodliwoœci jest również względne. Niektóre mutacje szkodliwe w podwójnej dawce genu mogš bowiem okazać się pozytywne, gdy gen występuje w dawce pojedynczej. Jako przykład można tu podać niedokrwistoœe sierpowatokrwinkowš; pojedynczy zmutowany gen daje odpornoœć na malarię, natomiast ten sam gen w podwójnej dawce jest przyczynš ciężkiej, nieuleczalnej choroby krwi. W rozdziale XI podano sposoby obliczania ezęstoœci mutacji. #V tym miejscu podamy dwa przy#łady z użyciem metod: bezpoœredniej i poœredniej. a) Obliczanie częstoœci mutacji achondroplazji - metoda bezpoœredniš. 126 Acbondroplazja jest chorobš przekazywanš w sposób autosomalny dominujšcy z pełnš penetracjš genu. W badaniach przeprowadzonych w Danii w nie wyselekcjonowanej populacji 94 097 noworodków wykryto 8 przypadków choroby; wszyscy rodzice tych dzieci byli zdrowi', uznano więc, że wszystkie stwierdzone przypadki choroby były wynikiem nowej mutacji. U 94 075 osób występuje łšcznie 2 X 94 075 = 188 150 miejsc genowych '*. Mutacja wystšpiła w 8 miejscach genowych, częstoœć mutacji zatem wynosi: 8 :188 150 = 0,00004 = 4 X 10## na jedno pokolenie. b) Obliczanie częstoœci mutacji w stwardnieniu guzowatym (scleros%s tuberosa) metodš poœredniš. Badania przeprowadzone zostały w Polsce w 1968 r. Najpierw obliczono częstoœć występowania stwardnienia guzowatego w populacji ogólnej. Ustalono, że częstoœć występowania tego schorzenia w domach opieki dla osób z głębszym stopniem upoœledzenia umysłowego wynosi l,lo/o. Badania przeprowadzone wczeœniej, pozwoliły na ustalenie, iż głębs#e upoœledzenie umysłowe w Polsce występuje z częstoœciš 0,4o/o. Częstoœć stwardnienia guzowatego w Polsce można więc było oszacowae na: 11 : 1000 X 4 : 1000 = 44 : 1000000. Dokładne badania rodzinne oraz analiza rodowodów, w których występowały przypadki stwardnieaia guzowatego, pozwoliły na stwierdzenie, że w połowie rodzin choroba ta wystšpiła po raz pierwszy - przypadki te uznano za nowe mutacje. Częstoœć mutacji otrzymujemy, mnożšc częstoœć występowania choroby przez proporcję nowych mutacji (1/r); otrzymanš wartoœć mnożymy jeszcze raz prze# '/e, ponieważ, jak podano wyżej, częstoœć mutacji podaje się w odniesieniu do liczby miejsc genowych: 44 ů 10#" X #/z X #/z = 11 X 10#" Częstoœć mutacji stwardnienia guzowatego wynosi więc 11 na milion miejsc genowych na jedno pokolenie "*. Częstoœć mutacji można też obłiczać innš metodš poœredniš, która oparta jest na założeniu, że między mutacjami a selekcjš istnieje stan równowagi. Metoda ta posługuje się pojęciem "przystosowanie genetyczne", które wyraża się stosunkiem prawdopodobieństwa, że osoba dotknięta danš chorobš będzie mieć chorego potomka (a więc będzie w stanie przekazać gen choroby na następne pokolenie) do prawdopodobieństwa tego, że zdrowy członek rodzeństwa tej osoby będzie mieć zdrowego potomka. Jest to tzw. wskaŸnik różnicowy płodnoœci. Częstoœć mutacji (#n.) dla dziedziczenia autosomalnego dominujšcego wyraża się wzorem: m = #/2 ' a (1 - f) gdzie: m oznacza częstoœć mutacji, n - częstoœć genu, f - przystosowanie genetyczne. Wszystkie osoby dotknięte stwardnieniem guzowatym, które zostały uwzględ ' W przypadku choroby dominujšcej, charakteryzujšcej slę pelna penetracjagenu, stwierdzenie. iż rodzice chorego dziecka sš zdrowi, uważa się za dowód na powstanie nowej mutacji. " CzgstoœE mutacji podaje się w przeliczeniu na liczbę m3ejsc genowych danej populacji, tzn. na liczbę chromosomów, na których darty gen może występowaE. '*' W póŸniejszym okresie obliczenie to przeprowadzono ponownio na podstawie nieco innego materiatu i otr#ymano wartoœE 18x10#i. 121 nione w powyższym obliczeniu, dotknięte były upoœledzeniem umysłowym głębszego stopnia, można je więc uznać za całkowicie niezdolne do reprodukeji. Możemy więc uznać, że f = 0. Zatem: m # #/2 ů 22 ů l0#g. (1 - 0) = 11 X 10#" NIEZALE#NA SEGREGACJA, REKOMBINACJA I SPRZ#ŻENIE Drugie prawo Mendla o niezależnym dziedziczeniu genów - w œwietle póŸniejszych badań - wymaga uzupełnienia. Okazało się bowiem, że niezależne dziedziczenie dotyczy nie wszystkich miejsc genowych. W istocie wzajemna względem siebie pozycja genów deeyduje o tym, czy podlegajš one segregacji niezależnej, czy też nie. Miejsca genowe znajdujšce się na niehomologicznych chromosomach zawsze podlegajš - tak jak to ustalił Mendel - segregacji niezależnej. Geny znajdujšce się na tym samym chromosomie zazwyczaj przekazywane sš jednak łšcznie, tak więc ich segregacja nie jest niezależna, chociaż musimy pamiętać, że podezas koniugacji, w mejozie często dochodzi do wymiany (crossing over) częœci materiału genetycznego pomiędzy homologicznymi chromosomami; skutkiem tej wymiany jest rekombinacja częœci materiału genetycznego w obrębie chromosomów. Prawdopodobieństwo łšcznego przekazania dwóch genów przynależnych do tego samego chromosomu zależy od odległoœci, jaka je od siebie dzieli. Im większa jest to odległoœć, tym większa jest œzansa, że zostanš od siebie oddzielone podezas crossing over. Jeżeli zatem geny takie znajdujš się w dużej odległoœci od siebie - np. na przeciwległych końcach chromosomu o stosunkowo dużych wymiarach, wówezas erossing over może wystšpić pomiędzy nimi nawet kilkakrotnie, co sprawia, że segregujš one niezależnie. Geny znajdujšee się na tym samym chromosomie okreœlamy jako synteniczne, a geny blisko siebie położone, segregujšce zazwyczaj łšcznie - jako sprzężone. Tak więc syntenia nie zawœze jest równoznaczna ze sprzężeniem. Za miarę odległoœci pomiędzy dwoma genami na danym chromosomie przyjmuje się iloœć powstajšcyeh na tym odcinku rekombinacji (w wyniku wymian - crossing over); dzielšc liczbę gamet zrekombinowanych przez liczbę gamet niezrekombinowanych oblicza się tzw. frakeję rekombinacji pomiędzy miejscami genowymi, a odległoœć pomiędzy nimi wyraża się w jednostkach mapy genowej. Jednostka mapy genowej odpowiada lo/o rekombinacji pomiędzy miejscami genowymi - okreœla się jš również jako jeden eentiMorgan (crJ1)'. Na przykład odległoœć 4 jednostek mapy genowej (4 cM) jest równoznaczna z 4o/o rekombinacji pomiędzy danymi miejscami genowymi. Częstoœć rekombinacji, jak już wspomniano, wzrasta w miarę zwiAkszania się odległoœci pomiędzy genami aż do 50o/o - wartoœci charakterystycznej dla genów usytuowanych na chromosomaeh niehomologicznych. W zwišzku z tym o sprzężeniu mówi się wówezas, gdy odsetek rekombinacji jest mniejszy niż 50o/o (50 cM). Całkowita długoœć genetyczna haploidalnego zestawu chromosomów człowieka wynosi ok. 3000 cDJ1 **. Długoœć genetyczna chromosoma 1 w genomie * 1 cM odpowiada prawdopodobnie w przybliżeniu I milionowi par zasad. *' Chiazmy widoczne pod mikroskopem w materiale biopsyjnym z gonad męskich sš uchwytnym morfologicznie dowodem na erossing over, szyli dokonujšcš się rekombinacjq. Jedna wymiana (srossing over) jest równoznaczna z 50A6 rekombinacji, czyli 50 cA#1. Jak wykazujš obserwacje, w mejozie u mężezyzny ne 128 człowieka - stanowišeego 9ojo całkowitej długoœci haploidalnego zestaww autosomów - wynosi przynajmniej 250 cM, a więc geny usytuowane na, końcach tego chromosomu, mimo iż sš synteniczne, nie sš sprzężone. :#lAPOWANIE GENllW W GENOMIE CZŁOWIEKA Badania nad sprzężeniami genów u muszki owocowej zapoczštkowali w 1911 r. Thomas Hunt Morgan i wsp. Natomiast zasługa przypisania pierwszeg# genu d# chromosomu u ezłowieka przypadła w udziale Wilsonowi (również w 1911 r.), który wydedukował, że gen œlepoty na barwy znajduje się na chromosomie X. W cišgu następnych lat, na podstawie analizy rodowodów, przypisano wiele innych genów do chromosomu X. Przypisanie pierwszego genu do autosomu nastšpiło dopiero w 1968 r., kiedy to Donahue i wsp udało się uzyskać dowód na to, że gen grupy krwi Duffy znajduje się na chromosomie 1; grupa Duffy w badanym rodowodżie segregowała łšcznie# z ehromosomem 1 o wydłużonym odcinku heterochromatycznym. Jednakże w okresie poprzedzajšcym to odkrycie kilku badaczom - rów= nież na podstawie analizy rodowodów - udało się ustalić sprzężenie po= między niektórymi genami autosomalnymi - bez przypisania ich do konkretnych chromosomów. I tak np. ustalono sprzężenie pomiędzy grupš krwi Lutheran i cechš secretor (wydzielacz) (1951 r.); w 1955 r. Renwick i Lawler ustalili sprzężenie pomiędzy genem grup krwi ABO i zespołem rzepkowo-paznokciowym (dominujšcy zespół wad rozwojowych) stwierdzajšc tylka 13o/o rekombinaeji *. Od 1960 r. do analizy sprzężeń zarzęto stosować programy komputerowe; znacznie udoskonalono je w latach siedemdziesištych. Prawdziwš karierę w mapowaniu chromosomów człowieka zrobiła metoda międzygatunkowej hybrydyzacji komórek somatycznych. Już w 1960 r. Barski po raz pierwszy stwierdził możliwoœć otrzymania hybr#d (mieszańców) komórkowych w ho= dowli dwu różnych nowotworowych linii komórkowych myszy. W 1964 r. Littlefield opracował metodę pozwalajšcš na izolację czystych linii komórek hybryd spoœród komórek wyjœciowych, polegajšcš na zastosowaniu pożywek selektywnych. W 1967 r. Weiss i Green uzyskali po raz pierwszy mysio-ludzkš hybrydę komórkowš. Zwrócili przy tym uwagę na zachodzšcš stopniowo utratę ehromosomów człowieka z linii mieszańca. Po raz pierws-zy zdano sobie wówezas sprawę, że międ#ygatunkowe hybrydy (zazwyczaj człowiek-mysż lub człowiek-chomik) mogš stanowić nieocenione narzędzie w badaniach nad sprzężeniami genetycznymi. W metodzie hybrydyzacji komórek somatycznych niezbędne jest także zastosowanie badań biochemicznych - w celu wykrycia ludzkich znaczników (markerów) enzymatycznych, przy czym enzym można uważać za znacznik, jeœli jego forma występujšea u człowieka może być odróżniona od homologicznej formy enzymu występujšcego u myszy lu# chomika. Można wyprowadzie linię komórkowš mieszańca, w której znajduje się tylko kilka chromosomów człowieka lub tylko fragment któregoœ z chromoso 22 autosomy pr#ypada ok. 52 chiazm. Stšd całkowitš dtugoœć genetycznš autosomów można szacować na ok. 2600 cM, a lšcznie z ehromosomami ptciowymi naok. 3000 cM. * Dziœ wiadomo, żc geny grupy Lutheran i cechy secretor znajdujš się nn chromosomie 19, a geny grupy ABO i zespołu paznokciowo-rzepkowego na chromosomie 9. # - Zarys genetvk# 129 #nów człowieka ", co nierzadko, po przeprowadzeniu badań, o których mowa, pozwala na ustalenie, że gen warunkujšcy obeenoœć u hybrydy danego znacz;nika biochemicznego (np. enzymu) znajduje się na okreœlonym chromosomie lub w okreœlonym odcinku tego chromosomu. Metoda hybrydyzacji komórek somatycznych była, jak dotšd, najbardziej wydajna w mapowaniu genomu #człowieka. Spoœród wielu innych metod stosowanych w tym celu wymieńmy tu jeszcze trzy : - Metodę dawki genu - opartš na stwierdzeniu korelacji pomiędzy okreœlonš aberracjš chromosomalnš a zawartoœciš produktu danego genu. Na pizykład w trisomii można spodziewać się zwiększenia zawartoœci niektórych produktów w zwišzku z obecnoœciš trzech zamiast dwóch alleli; od~wrotnie w przypadkach delecji, w których zamiast dwóch alleli obecny jest tylko jeden. W ten sposób przypisano np. fosfatazę kwaœnš 1 do chromoso#mu 2. - Metodę hybrydyzacji żn situ z zastosowaniem sond RNA lub DNA, znakowanych np. izotopem promieniotwórczym. Sonda taka, zawierajšca znana #sekwencję RNA lub DNA, otrzymana metodami stosowanymi w inżynierii #genetycznej, odszukuje swój odpowiednik w jednym z chromosomów i hybryůdyzuje z nim; można to wykazać za pomocš autoradiografii. - W cišgu ostatnich lat w mapowaniu genomu człowieka zastosowano także metodę opartš na badaniu polimorfizmu długoœci fragmentów restrykcyjnych DNA - z zastosowaniem różnych enzymów restrykcyjnych (endonukleaz) produkowanych przez bakterie (patrz rozdział XVI). Do 25 marca 1988 r. udało się zmapować łšcznie 1941 miejsc genowych, #w tym : 776 - metodš hybrydyzacji komórek somatycznych, 362 - metodš hybrydyzacji żn situ, 334 - metodš analizy sprzęŸeń w poszczególnych rodzinach, 117 - metodš dawki genu, 77 -metodš polegajšcš na wykorzystaniu polimorfizmu długoœci fragmentów restrykcyjnych DNA, 275 - za pomocš innych metod. Niektóre geny mapowano przy użyciu dwu lub kilku metod. O tym, jak 'bardzo szybko dokonuje się postęp w tej dziedzinie, może œwiadczyć fakt, że 480 miejsc genowych, a więc 25a/#, zmapowano w cišgu niespełna roku .#od 15 kwietnia 1987 do 25 marca 1988 r.). Przykłady chorób genetycznie uwarunkowanych, których geny zostały już zmapowane podano w tabelach 19, 20 i 22. LIGZBA GENbW DáTYCHCZAS ZIDENTYFIKOWANYCH U CZŁOWIEKA "Według McKusicka do 25 marca 1988 r., głównie na podstawie cech fenotypowych, wykazujšcych se#regację mendlowskš, zidentyfikowano łšcznie -4361 ** fenotypów, z tego: 2570 (5.9'!'#) autosomalnych dominujacych, 1479 (34'#",) autosomalnych recesywnych i 312 (7"/#) recesywnych sprzężonych z płciš. t W metodzie tej a#ykorzystuje się material pobrany od osób z różnymt struktu-ralnymi aberracjami chromosomów, dzieki czemu można otrzymać linie komór#kowe mieszańca zawieraiace różne fra#mentv dowolnego chromosomu. ** W tym 2141 jednostek wymaga jeszcze weryfikacji. i30 T a b e 1 a 24. Liczba zidentyfikowanycb miejsc genowych głównie na podstawie, segregacji mendlowskiej wg McKusicka (1988) Rok Miejsca genowe Lšcznle lp. wydania Autosomalne Autosomalne Sprzężone z dominujšcerecesywne chromosomem 1966 wyd. pierwsze837 (269)531 (237) 119 (68) 1487 (574) 1975 wyd. czwarte 1218 (583) 947 (466) 171 (93) 2336 (1142) 1986 wyd. siódme 2201 (1172) 1420 (610) 286 (124) 3907 (1906) 1988 wyd. bsme` 2559 (1442) 1477 (626) 310 (139) 4346 (2207) W nawiasach podano liczbę jednostek uznanych jako pewne (potwierdzone). " Lista zamknięta w dniu 1 marca 1988 r. Poczšwszy od 1966 r., co kilka lat, ukazuje się Katalog fenotypów uwarunkowanych obecnoœciš pojedynczych genów - w opracowaniu McKusicka. Katalog zawiera listę wszystkich zidentyfikowanych pozycji wraz ze# zwięzłš charakterystykš odpowiednich fenotypów. W tabeli 24 podano liczby zidentyfikowanych fenotypów w czterech wydaniaeh katalogu - w tym# pierwsze (1966 r.) i ostatnie (1988 r.). Prawie czterokrotny wzrost tej liczby można uznać za wykładnię post#pu w genetyce człowieka w cišgu ostatnich: 22 lat. Z drugiej strony należy zdawać sobie sprawę z tego, jak wielki jest jeszcze obszar naszej niewiedzy w tej dziedzinie. Liczbę genów strukturalnych: w genomie człowieka szacuje się bowiem na od 50 tysięcy do. 100 tysięcy, geny dotychczas zidentyfikowane stanowiš więc, w najlepszym razie, od 4 do 9o/o puli genowej człowieka. PODSUMOWANIE W rozdziale omówiono typy dziedziczenia jednogenowego, nawišzujšc do, praw Grzegorza Mendla, podano proporcje genetyczne charakterystyczne dla poszczególnych typów dziedziczenia, sposoby obliczania proporcji genetycznej i uwalniania się od błędu selekcji w tych obliczeniach. Krótko omówiono. mechanizmy mutacji; z przykladami obliczania częstoœci mutacji w populacji ogólnej. Wymieniono niektóre metody mapowania genów, a także podana liczbę fenotypów zidentyfikowanych u człowieka do 1988 r. VIII. Uwa#unkowanie wieIocz#nnikowe lgnacy Wald #ixENETYKA C#:CH ILOSCIOWYCH A GENETYKA 1\ZENDLOWSKA Obok cech segregujšcych w rodzinach dziedżiczonych zgodnie z zasadami Mendla spostrzegano od dawna występowanie podobieństwa rodzinnego, którego dziedziczenie odbiegało od tych zasad. Jesżeze w XIX wieku badacz angielski F. Galton zaproponował metody majšce służyć do porównywania cech różnych członków rodziny. Metody te, a zwłaœzeza współezynniki regresji i korelacji, były wykorzystywane do porównywania cech pomiędzy różnymi typami krewnych oraż do porównania wartoœci cech w okreœlonych grupach #sób i w populacji ogólnej. Służyły sżezególnie dobrze do badania cech wykazujšcych zmiennoœć iloœciowš, takich jak np. wzrost lub masa ciała. Tak ;ię więc złożyło, że z poczštkiem XX wieku rożwijały się dwa typy badań genetycznych - genetyka mendlowska, zajmujšca się przede wszystkim badaniem cech jakoœe;owy#h, i genetyka cech iloœciowych, wykorzystujšca techniki korelacyjne. Dopiero w 1918 r. z#Tybitny statystyk brytyjski R. A. Fisher wykazał, że ůw;:półezynniki korelacji uzyskiwane przy porównywaniu cech iloœciowych można wytłumaczyć, zakladajšc, że cecha jest uwarunkowana przez wiele genów o wpływie addyty#,#nym. Okazało się zatem, że nie ma, jak przypuszezano dawniej, zasadniezej różnicy między genetykš m#dlowskš a genetykš ilo;f'IOV4 š. Tak więc genetyka iloœciowa jest w gruncie rzeczy badaniem dciedżiczenia wielogenowego. W uwarunkowaniu cech zależnych od wielu czynników oprócz genów istotnš rolę mogš odgrywać również c#ynniki zewnštrzpochodne. Dlatego też coraz częœciej zamiast o dziedziczeniu wielogenowym mówi się o uwarunkowaniu wieloczynnikowym, obejmujšcym zarówno uwarunkowania geńetyczne wielogenowe, jak i wpływ różnych czynników zewnętrznych. Idealnym modelem dziedziczenia wieloczynnikowego jest ten, w którym ceeha zależy od dużej liczby drobnych czynników addytywnych. Wykresem takiej zależnoœci jest dobrze znana krzywa Gaussa, krzywa rozkładu normalnego, znajdujšcego ważne zastosowania w badaniu zjawisk biologicznych. Nierzadko jednak w analizie konkretnego zjawislsa spotykamy się z różnymi rzynnikami zakłócajšcymi addytywnoœć, takrmi np. jak dominacja, epistaza, niejednorodnoœć genetyczna itd. Dlatego też badacz analizujšcy zjawiska uwarunkowane wieloezynnikowo chętnie dšży do rozszezepienia ich na grupy proœciej uwarunkowane. Niemniej analiza wieloczynnikowa jest istotna do żbadania różnyeh cech o zmiennoœci cišgłej, a także różnych częstych zaburzeń takich jak wady rozwojowe czy inne choroby, jak miażdżyca, cukrzyca cz# sehizofrenia. 132 W analiza-ch takich cech istotne zna#zenie majš metody szacujšce wzajemnš rolę uwarunkowania dziedzicznego i œrodowiskowego. Szezególne znaczenie majš tutaj techniki badania bliŸništ i badania dzieci adoptowanych. BADAlVIE BLINIf#T Badanie b?iŸništ wprowadzone zostało przez F. Galtona w 1875 r. jako metoda, lstóra miała rozstrzygnšć o wzajemnej roli ezynników dziedzicznych i œrodowiskowych w warunkowaniu cech. Badania następne wykazały, że sprawa nie jest tak prasta, niemniej metoda ta odegrała historycznš rolę w rozwoju genetyki ezłowieka. BliŸnięta monozygotyczne i dizygotyczne (jedno- i dwujajowe). Cišża bliŸniacza zdarza się w populacjach europejskich w częstoœci mniej więcej 1 na 90. Oznacza to, że co 45 dziecko ma brata lub siostrę bliŸniaka. BliŸnięta mogš być monozygotyczne, pochodzšce z podziału tej samej zygoty i majšce identyczny genotyp, lub dizygotyczne, u których proporeja wspólnych genów jest taka sama jak u z#.uykłego rodzeństwa. Częstoœć rodzenia się bliŸništ monozygotycznych jest różna w różnych populacjach, w Europie wynosi ok. 30o/o= Najprostsza technika szacowania częstoœci par monozygotycznych polega na porównaniu z częstoœciš rodzenia się bliŸništ różnopłciowyeh, które z reguły sš dizygotyczne. Jeżeli zalożye, że częstoœć bliŸništ dizygotycznych tej samej płci jest taka sama jak częstoœć bliŸništ różnopłciowych, to wystarezy podwoić liczbę par różnopłciowych i odjšć jš od liczby wszystkich bliŸništ, by otrzymaE pierwsze przybliżenie liczby bliŸništ monozygotycznych. Odróżnienie bliŸnżšt mono- i dizygotycznych opiera się obeenie na porci#xrnaniu wielu cech bioehemicznyc,h ciotyczšcych krwinek i osecza, które b#dš takie same u bliŸništ monozygotycznych, mogš być natnmiast rozmaite u bliŸništ dizvgotycznych. Przy odpowiednio dużej liczbie cech można szacowa# prawdopodnbieństwo monozygotycznoœci # dokładnaœciš przekracza;šcš 99o/o. Zdarzajš się jednak niezwykle rzadkie przypadki, że u jednego z bliŸni#t mnnozygot5#cznych już po podziale zygoty może dojœ## do powstania jakiejœ annrnalii. I tak, znane sš przvpadki wystšnieni„ zespołu Downa lub zespołu Turnera u jednego z bliŸništ mnnozygotycznych, sš one jednak bardzn rzadkie. Waine znaczenie w iagnnstyce monozygotyeznoœci rno#e mieć przyjriro#vanie przeszezepu skórnego bliŸniaka. Załnżeniem "metody bliŸništ" jest to, że wszelkie różnice pomiędzy bli#niętami monozygotycznymi przypisuje się wpływowi œrodowiska i porównuje si# je z różnicami u bliŸništ dizy#ntycznych. Jako miarę odziedziczalnnœci, jeœli chodzi o cechy jakoœciowe, stosowano często wzór Holzingera (II): Z,#z - Z#z H = 1 - Zn# gdzie: Z oznaeza z#odnoœć występowania cechy u bliŸništ mono- lub dizy#. tycznych. Wzór ten jest bardzo niedokładny i używa się go tylko jako pierwsze#6 przybliżenia. Dla cech iloœciowych używano wzoru: VDZ, V NL VDz gdzie: V#z i Vnz oznacza warianeje odpo#iednio u bliŸništ mono- „ di2ygot#cznych: 133 Badanie bliŸništ nie odpowiada na pytanie, jaki jest typ dziedziczenia cechy. Istniejš ponadto różne czynniki wpływajšce na ograniczenie wartoœci tej metody, m.in. podobieństwo œrodowiska rozwoju bliŸništ, zarówno w okresie życia łonowego, jak i po urodzeniu, sposobu doboru par bliŸništ i inne. Dlatego też szczególne maczenie majš takie badania w których dobór bliŸništ prowadzi się nie dlatego, że majš one jakšœ cechę lub jej nie,majš, le#z tylko dlatego, że sš bliŸniętami. T a b e 1a 25. Zgodnoœć występowania niektórych chorób u bliŸništ mono- i dizy-gotycznych (wg Haugego) Zgodnoœć Choroba bliŸnięta bliŸnięta dizygo- monozygotyczne tyczne tej samej płci Padaczka 10/27r 6/43 Psychoza maniakalno-depresyjna 10/15 Schizofrenia 4/9 4/33 Nadciœnienie tętnicze 20/80 10/106 Zawał serca 22/84 22/159 Udar mózgowy 22/98 16/148 GruŸlica 50/135 42/267 fteumatoidalne zapalenie stawów 16/47 2/71 Dychawica oskrzelowa 30/64 24/101 # W liczniku podano liczby par zgodnych w mianowniku liczby wszystkich par, w których co najmniej u jednego członka stwierdzono cechę. Podobnie zasługujš na uwagę badania,w których analizuje się szezególnie bliŸnięta wychowywane oddzielnie. Z tego punktu widzenia interesujšce sš zwłaszcza badania prowadzone w Danii.Instytut Genetyki Człowieka w Ko-penhadze prowadził bowiem rejestr wszystkich bliŸništ urodzonych w latach 1870-1910.Tabela 25podaje wyniki dotyczšce niektórych ehorób. BADANIE DZIECI ADOPTOWANYCH Innš metodš oszacowania wzajemnej roli czynników genetycznych i œrodowiskowych jest badanie dzieci adoptowanych i porównanie ich cech z cechami rodziców biologiczn#ch i społecznych. Metoda ta jest łatwiejsza do zastosowania w badaniu cech jakoœciowych. Jest ona możliwa do stosowania tylko w tych społeczeństwach, gdzie prowadzi się rejestr adopcji. Przykładem takiego badania jest praca wykonana przez S. S. ftety'ego i wsp. na podstawie rejestrów duńskich dotyczšcych dzieei adoptowanych oraz rejestru psychiatrycznego. Badaniem objęto lata 1924-1947. Z 507 osób wychowanych przez rodziców adoptowanych i przyjętych do szpitala psychiatrycznego wybrano 33 probandów hospitalizowanych z powodu schizofrenii. Dobrano również odpowiedniš grupę kontroinš, odpowiadajšcš probandom pod względem płci, wieku, wieku adopcji f stanu ekonomicznego rodziny adoptujšcej. Następnie przeprowadzono badanie zaburzeń psychicznych występuj#cych u biologicznych i adoptowanych krewnych. Dane te przedstawia tabela 26. Jak wynika z tabeli, u biologicznych krewnych probandów stwierdza aię 1# T a b e 1 a 26. Występowanie sehizofren wœród biologicznych i adoptowanych lere- rt-nyeh probandów ze sehizofreniš i osób kontrolnych Probandzi Chony 13' 50 74 Kontrolni 3 156 83 0,0072 >0,05 ' W liczniku podano liczbę osób z rozpoznaniem sehizofrenii, w mianowniku liczbę zbadanych krewnych. Punktem wyjœcia dla próby były 33 osoby z rozpoznaniem sehizofrenii oraz 33 osoby kontrolne. T a b e 1 a 27. Częstoœć rozpoznania sehizoFrenii wœród krewnych biologicznych l adoptowanych probandów z rozpoznaniem sehizofrenii Iub kontrolnych Probandzi Krewni biologiczni 9' 4 Chorzy 93 25 Kontrolni 0 51 0,0018 70,05 ' W liczniku liczba osób z rozpoznaniem sehizofrenii, w mianowniku liczba badanych krewnych. Próba obejmuje 19 probandów ehorych i 20 kontrolnych oddzielonych od rodziców biologicznych w pierwszym miesišcu życia. większš częstoœć sehizofrenii niż u krewnych adoptowanych. Dane te potwierdzajš się wówezas, gdy próbę ograniczy się do grupy osób, które zostały adoptowane w pierwszym miesišcu życia (tab. 27). Tabele 26 i 27 wskazujš w istocie na rolę czynników biologicznych, ponieważ matka jest dla dziecka nie tylko żródłem genów, ale także Ÿródłem innych wpływów niegenetycznych. Jednak dalsze badania, prowadz#ne na materiale adoptowanego rodzeństwa naturalnego, majšcego wspólnego ojca, potwierdzajš tezę, że istotnš rolę odgrywajš tutaj czynniki genetyczne jtab. 28). Metoda badania dzieci adoptowanych unika pewnych trudnnœci zwišzanych z metodš bliŸništ, stwarza jednak tyle nowych trudnoœci, że zastosowanie jej jest dosyć ograniczone. Podnbnie jak metoda bliŸništ, i ta technika nie potrafi wskazać typu przekazywania dziedzicznego. Krewni biologiczni Krewni adoptowani Krewni adoptowani T a b e 1 a 2R. Występowanie sehizofrenii u rodzeństwa naturalnogo majšce#o wspól- nego ojca, probandów ze sehizofreniš i kontrolnych Probandzi (liczba) Chorzy (33) Kontrola (34) p (chorzy w porównaniu z kontrolš) Liczba rodzeństwa naturalnego majšcego wspólnego ojca 63 64 #0,05 Liczba osób z rozpoznaniem sehizofrenii 14 2 C0,001 135 MIAIZY S#OSOWANE W ANALIZIE CECH UWA #UNKOWANYCH WIELOCZYNNIKOWO Przy cechach uwarunkowanych wieloczynnikowo podstawowš metodš postępowania jest ocena podobieństwa między krewnymi. Stosuje się do tego zazwyczaj współezynnik korelacji. Jeżeli korelacja między krewnymi odpowiada proporeji genów wspólnych (tzn. identycznych i pochodzšcych od jednego przodka), to można wnosić, że cecha jest całkowicie uwarunkowana genetycznie, jeœli nie, to można analizować, jaka częœć zmiennoœci zależy od czynników dziedzicznych. Najezęœciej stosuje się dwie miary tego wpływu. Pierwszš jest odziedziczalnoœć w sensie szerszym albo stopień determinacji genetycznej, czyli stosunek zmiennoœci wywołanej ezynnikami genetycznymi do całkowitej zmieńnoœci VG fenotypowej -. Vp Drugš -tak zwana odziedziczalnoœć w znaczeniu węższym. czyli proporeja zmiennoœei wywołanej czynnikami addytywnymi do całxowitej zmiennoœci fenotypowej -. VA Vp i zi b 21 a 29. Proporeja gen#w svspólnych u osób spokrewnionych Stox#„eń pokrewieństra#z # Pronoreje genów wspólnych 1_ Rodzice,dziecko,rodzc:ństwo BliŸniak znonozygotyczny __1 BliŸniak dizygotyezny Dziadek, babka, wnuki, wujek, ciotka, bratanek siostx'zeniec,rodzeństwo przyrodnie 4 1 Kuzyn z pierwszej linii Kuzyn z drugiej linii 1 32 Tabela 29 przedstawia proporeje genów wspólnych przy różnych stopniach prawdopodobieństwa. Niekiedy, jako pożytecznš miarę podobieństwa, stosuje się korelację między œredniš wartoœciš u rodziców a probandem. Przy dziedzicaeniu addytywnym wartoœe ta wynosi j# '/Q, czyli 0.91. Korelacje przy dziedziczeniu wieloczynnikowym wypadajš optymalnie, jeœli geny majš właœciwoœci addytywne i nie ma dominacji. Jeœli występuje dominacja, to współczynnik korelacji między krewnymi zmniejsza się. lnnym czynnikiem wpływajšcym na wartoœć współezynnika korelacji między #rewnymi jest stopień podobieństwa rodziców. Jeœli korelacja między rodzicami względem danej cechy wynosi #r,, to korelacja rodzice - dziecko i korelacja między rodzeństwem staje sig 1 + #, korelacja zaœ między œredniš 1 -ł- 7n. wartoœciš cechy u rodziców i u dzieci wynosi2 # #,  Cechš klasycznie uważanš za zależnš prawie wyłšcznie od działania wieIu #ar genów addytywnych była całkowita liczba listewek skórnych opuszek paledw. Wœpółezynniki korelacji między krewnymi prawie całkowicie odpo- wiadały oczekiwanej proporeji genów wspólnych. Dziœ wiadomo, że sprawy te sš nieco bardziej skomplikowane, niż t# pierwotnie przypuszezano. Tabela 30. Podobieństwo między krewnymi badane za pomocš współezynnika korelacji dla niektórych cech u człowieka (wg Bodmera i Cavalii-Sforza) Współezynniki korelacji Cecha rodzice - dziecko # rodzeństwo Wzrost 0,51 0,56 Iloraz inteligeneji 0,48 O,„8 Całkowita liczba listewek skórnych 0,48 0,5Q Skurezowe ciœnienie tętnicze krwi 0,24 0,33 Również i inne cechy iloœciowe takie jak wzrost, długoœć koœci długich, wskaŸnik inteligeneji, zależš w znacznej częœci od dziedziczenia wieloczynnikowego, przy czym rola czynników genetycznych może być dosyć znaczna. Tabela 30 wskazuje na podobieństwo między krewnymi badane za pomocš współezynnika korelacji dla niektórych cech u człowieka. Analiza danych dotyczšcych ciœnienia krwi pozwala na oszacowanie odziedziczalnoœci w wšskim znaczeniu tego słowa na 48o/o, a odziedziczalnoœci w szerokim znaczeniu tego słowa na ok. 80o/o. Analiza podobieństwa między krewnymi, jeżeli chodzi o wskaŸnik inteligeneji, napotyka istotne trudnoœci. Zależš one od r„żnych przyczyn. Po piex`wsże, wartoœci tej cechy w znacżnym stopniu zależš od jej definicji i stosowanych metod pomiaru, które się różniš znacznie bardziej niż przy ocenie cech somatycznych. Po drugie, oceniajšc pod tym względem podobieństwo migdzy rodzicami i dziećmi, mamy do czynienia nie tylko z dziedziczeniem biolo#ieznym, lecz również z dziedziczeniem kulturowym. Rodzice bowiem prz#kazujš d#ieciom nie tylko swoje geny, ale również wpływy wychowaweze. Po trzeeie, podobieństwo między rodzicami pod względem inteligeneji jest zazwyczaj doœć znaezne, a to, jak widzieliœmy wyżej, zwiększa równ„eż współczynniki korelacji między rodzicami a potomstwem i rodzeństwem. Dlatego też uzyskiwane w ten sposób wyniki stanowiš raczej maksymalne szacunl=i dla oceny roli czynników genetycznych. Pró#uje się uzyskać dokładniejsze œzacunki podobieństwa między rodzieami pod względem zdolnoœci poznawezych przez stosowanie różnych technik usilujšcych rozdzielić dziedziczenie kulturowe i bioiogiczne. Służš temu celowi próby badania bliŸništ monozygotycznych wychowywanych w różnyc.h warunkaeh œrodowiska, badania rodzin adoptowanych, badania krewnych różnych stopni itd. Niekiedy usiłowano wykorzystać badania genetycżne dotyczšce cech psychicznych w celu wykazania wyższoœci jednych ras nad innymi lub dowiedzenia biologicznych podstaw nierównoœci społecznych. Próby takie z reguły pozbawione sš podstaw naukowych. Przy analizie tego typu zjawisk należy również wzišć pod uwagę, że wysoki stopień uwarunkowania genetycznegu cechy nie przekreœla bynajmniej możliwoœci oddziaływania œrodowiskowego. Nawet przy proporeji roli czynników dziedzicznych przekraczajšcej 80o/o zmiennoœci cechy zostaje bardzo wiele miejsca na oddziaływanże œrodowiskowe. Przykładem tego jest m.in. taka cecha jak wzrost, odziedziczalnoœć jej 13# szacuje się na 83o/o. Wiadomo, że w cišgu ostatnieh 200 lat wzrost w popu- lacjach europejskich uległ istotnemu podwyższeniu. Zjawisko to znane jest jako tak zwany trend sekularny. Nie może ono zależeE od czynników gene- tycznych, ponieważ pula genów w populacjach europejskich nie uległa za- sadniczej zmianie i wszystkie dane wskazujš na to, że zależy ono od czyn- ników œrodowiskowych, m.in. dietetycznych. MODELE WIELOCZYNNIKOWEGO UWARUNKOWANIA CIiORÓá Analiza wielu częstych chorób wskazuje na to, że istotnš rolę odgrywajš w nich czynniki genetyczne; nie układajš się one jednak wg znanych praw Mendla. Do chorób takich można zaliczyć chorobę nadciœnieniowš, niektóre postacie miażdżycy, chorobę wrzodowš, niektóre postacie odczynów alergicznych, m.in. dychawicę oskrzelowš, niektóre postacie jaskry, łuszczycy, niektóre choroby psychiezne itd. Należš do nich również różne wady rozwojowe, takie jak wrodzone wady serca, rozszczep podniebienia, rozszczep wargi i podniebienia, wady oœrodkowego układu nerwowego i inne. Ryzyko wystšpienia choroby jest tym większe, im więcej dany osobnik ma genów patologicznych oraz im więcej działa na niego zewnštrzpochodnych czynników szkodliwych. Przy dziedziczeniu tego typu często zwraca uwagę zależnoœć częstoœci występowania choroby od stopnia spokrewnienia z probandem. Tak np. w różnych zaburzeniach wieloczynnikowych częstoœć występowania zaburzeń u rodzeństwa probanda jest podobna do częstoœci występowania zaburzeń u jego dzieci. Cecha ta z reguły nie występuje w dziedziczeniu jednogenowym reeesywnym, w którym chore dzieci rodzš się na ogół ze zdrowych rodziców. Ponadto, w miarę spadku proporcji genów wspólnych z probandem, zmniejsza się gwałtownie częstoœć występowanża choroby. To właœnie porównanie częstoœci występowania choroby u krewnych różnego stopnia oraz w populacji ogólnej stało się podstawš do konstrukcji rozmaitych modeli. Przy zmiennoœci omawianego typu mamy również do czynienia z występowaniem zjawiska prog'u. Prowadzi to do tego, że mimo iż zmiennoœć zależy od wielu czynników i ma charakter cišgły, to pr2ejawianie się cechy może być uwarunkowane progiem zależnym od właœciwoœci anatomicznych, fizjologicznych lub embriologicznych organizmu. Skutkiem istnienia efektu progowego powstaje niecišgioœć w manifestowaniu się cechy. Sytuację tę przedstawia rycina 69. iii#il### RozkTad częstoœci w populacji Rozk Tad częstoœci wœród chorych Ryc. 69. Modcl uwarunkowania wie-loczynnikowego z progiem (wg Falconera). 138 --# Podatnoœć cdTkowita (genetyczna i œrodowiskowal Zbliżony model, rozpatrujšcy tylko podatnoœć genetycznš i nie przyjmujšcy wprawdzie explicite założenia progu, ale wykładniczy wzrost ryzyka zachorowania przy wzroœcie podatnoœci genetycznej, pokazuje rycina 70. Taki model chorobowy można również konstruować na podstawie analiz rozpowszechnienia zaburzenia u krewnych różnych stopni i w populacji ogólnej. Na ogół przyjmuje się, że rozpowszechnienie wady uwarunkowanej wieloczynnikowo o charakterze progowym wœród krewnych pierwszego stopnia probanda jest hliskie pierwiastkowi z częstoœci tej wady w populacji ogólnej. -u Próg X Podatnoœć genetyCzna IIIIIIII RozkTad częstoœci w populacji p Prowdopodobieństwo zochorowania przy okreœlonym poziomie podatnoœci RozkTad częstoœci wœród chorych Ryc. ?0. Model uwarunkowania wieloczvnnikowego z wykladniczym narastaniem ryzyka zachorowania w miarę wzrostu podatnoœci genetycznej. =u # _ Populacja ogblna N I # Krewni llI stopnia ## Krewni I stopnia X# 2 5rednia Œrednia populacji chorych Ryc. 71. Model dziedziczenia wieloczynnikowego rozszczepu wargi i podniebienia. Na osi odciętych odlożono uwarunkowanš wielogenowo podatnoœć genetycznš. Rycina 71 przedstawia model wieloczynnikowego uwarunkowania rozszczepu wargi i podniebienia. Widać z niej, że wraz ze stopniem pokrewieństwa zmniejsza się szybko częstoœć występowania wady. Innš charakterystycznš cechš dotyczšcš wad uwarunkowanych wieloczynnikowo jest to, że jeœli wada w populacji występuje z różnš częstoœciš u róż 139 -. Podatnoœć genetyczna nych płci, to wystšpienie jej u osoby płci mniej naraeonej na ryzyko wady œwiadezy o znacznie większej podatnoœci genetycznej tej osoby na wadę. Zjawisko to po raz pierwszy opisane przez C. O. Cartera, można zilustrować badaniami nad wrodzonym zwężeniem odŸwiernika. Zaburzenie to występuje u chłopeów z częstoœciš ok. 5 na 1G00 urodzeń, a u dziewezšt ok. 1 na 1000 urodzeń. Chłopcy zatem sš pięciokrotnie bardziej narażeńi na ryzyko wystšpienia wady. Wada ta była niezwykle niebezpieezna dla życia noworodka. Dopiero w 1912 r. Ramstedt wprowadził doœć prostš metodę chirurgicznego leczenie tej wady - przecięcie błony surowiczej i mięœniowej w okolicy zwężenia. Dzięki temu zabiegowi wartoœć przystosowaweza dzieci z wrodzonym zwężeniem odżwiernika osišgnęła normę. Carter przeprowadził badania nad występowaniem zwężenia odŸwiernika u dzieci zrodzonych z rodziców, którzy sami mieli tę wadę i wykonano im operację Ramstedta. Wynikż prze„stawia tabela 31. i a :# e ? a 31. Częstoœć wysœępowania zwężen#a udŸwierizika u potomst#,a osób, kt‚re przebyly operaeję Hamsredta w porównaniu z częstoœciš w populacji ugólnej Typ potomstv-a Ryzylco # Wielokrotnoœć ryzyka w populacji Synowie chorych mężezyzn # X 11 18 Eórki chorych mężezyzn x24 42 Synowie chorych kobiet X40 1 5 1 Córki chorych kobiet x70 #al: wynika z tabe:i, potomstwo zrodzone z osób plci, u której wada występuje rzadziej, obcišżone jest większym ryzykiem wystšpienia wady aniżeli potomstwo zrodzone z osób, u których wada występuje częœciej. Zauważmy również, że podobnie jak w populacji ogólnej, próg jest niższy dla chłopców niż dla dziewezšt, stšd w potomstwie zarówno chorych mężezyzn, jak i chorych kobiet częœciej chorzy sš synowie niż córki. Dla wad rozwojowych uwarunkowanych wieloczynnikówo charakterystyczna może być również wiPksza skłonnoœć występowania cechy u potomstwa zrodzonego z małżeństwa spokrewnionego. Więkœza częstoœć małżeństw spokrewnionysh wœród rodzieów chorych jest wprawdzie charakterystyczna dla dziedziczenia recesywnego autosomalnego, niekiedy jednak może wskazywać na wieloczynnikowy charakter uwarunkowania. Ponadto ryzyko powtórnego wystšpienia wady w rodzinie przy uwarunkowaniu wieloczynnikowym (odmiennie od uwarunkowania jednogenowego) roœnie wraz z liczbš chorych dzieci w rodzinie. Innym wskaŸnikiem wieloczynnikowego charakteru wady może być porównanie zbieżnoœci jej występowania u bliŸništ mono- i dizygotycżnych. Ponieważ z punktu widzenia genetycznego bliŸnięta monozygotyczne sš identyczne, a bliŸnięta dizygotyczne sš zwykłym rodzeńœtwem, w przypadku cechy dominujšcej stopień zbieżnoœci między bliŸniętami monozygotyczrtymi 140 jest ok. dwa razy wi#kszy niż stopień zbieżnoœci między bliŸniętami dizygo-tycznymi. W przypadku cechy recesywnej stosunek ten nie przekracza 4:i.: Jeœli stopień zbieżnoœci u bliŸništ monozygotycznych przekracza ponad czte= rokrotnie stopień zbieżnoœci u bliŸništ dizygotycznych, to należy rozpatrywać możliwoœć uwarunkowania wieloczynnikowego. Analiza zaburzeń wieloczynnikowych wymaga doœć skomplikowanych metod matematycznych i doœć# żmudnych obliczeń. W kilku oœrodkach, zwłaszcza w oœrodku badań genetycz= nych uniwersytetu hawajskiego w Honolulu (N. N. Morton), opracowano pro= gramy maszynowe pomocne w rozróżnieniu cech przekazywanych jednogenowo i uwarunkowanyeh wieloczynnikowo. NIEJEDNOR,ODNOSĆ GENETYCZNA Koncepcja wieloczynnikowego uwarunkowania #aburzeń pozwala wprawdzie# na wyobrażenie sobie mechanizmów ich powstawania, często nie pozwala jednak na wykorzystanie znanych wskaŸników biologicznych dla diagnostyki: i nierzadko zmusza do poprzestania na ryzyku empirycznym przy stawianiu diagnozy genetycznej. Jest dlatego rzeczš naturalnš, że genetycy medyczni upar„e dšżš do rozczłonkowania zaburzeń okreœlanych jako wieloczynnikoweů i do wyadrębnienia z nich bardziej jednoczynnikowo uwarunkowanych zespołów. Mamy więc do czynienia z procesem zbliżonym do tego, który zachodzi w genetyce chorób uwarunkowanych jednoczynnikowo w miarę poznawania niejednorodnoœci genetycmej lub molekularnej. Postaramy się obecnie pokazać dšżenie do wykazania takiej niejednorodnoœci na przykładzie niektórych częstyeh chorób. Tak np. jednš z choróh o największym znaczeniu społecznym jest miażdżyca, kojarzšca się nierzadko z nadciœnieniem i prowadzšca do zmian narzšdowych m.in. do choroby wieńcowej, chorób naczyń mózgowych itd. Tradycyjnie przyjmuje się, że miażdży= ca jest zaburzeniem uwarunkowanym wieloczynnikowo. Badania ostatnich lat pozwoliły na wyróżnienie wielu odrębnie uwarunkowanych zespołów. Tak np. częœć przypadków miażdżycy wywołana jest przez hipercholesterolemię rodzinnš przekazywanš jako cecha autosomalna dominujšca, a wywoływana przez defekt receptora lipoprotein o niskiej gęstoœci# (LDL - low density lipoproteins). Niektóre postacie wywołane sš przez uwarunkowane jednogenowo hipertriglicerydemie lub defekty apolipoprotein. Częœć przypadków jednak dalej musi być traktowana jako zaburzenie wieloeynnikowe. Innym przykładem takiej niejednorodnoœci jest choroba wrzodowa. I jš traktowano jako zaburzenie uwarunkowane wieloczynnikowo. Wkrótce okazało się, że aczkolwiek czynniki genetyczne odgrywajš rolę w chorobie wrzo= dowej o różnej lokalizacji, to zaznacza się odrębnoœć między chorobš wrzo= dowš żołšdka a chorobš wrzodowš dwunastnicy. Dalsze badania nad skojarzeniem występowania choroby wrzodowej z różnymi wskaŸnikami biologicznymi doprowadziły do wykrycia asocjacji z różnymi wskaŸnikami, takimi jak: grupa krwi 0, zawartoœć pepsynogenu I, zawartoœć gastryny w surowicy krwi, szybkoœć opróżniania żołšdka itd. Okazało się m.in., że jest grupa przypadków choroby wrzodowej dwunastnicy skojarzonej# ze zwiększonš zawartoœciš pepsynogenu I we krwi wykazujšca autosomalno-dominujšcy typ dziedziczenia. Przykładem takiego dšżenia do rozczłonkowania jednego wieloczynnikowego zaburzenia na wiele odrębnych jednostek jest próba klasyfikacji genetycznej choroby wrzodowej podana przez J. Rottera: 14L I.Choroba wrzodowa skojarzona z rzadkimi zespolami genetycznymi. A. Mnoga gruczolakowatoœE gruczolbw wydzielania wewnętrznego typ I. B. Mastocytoza układowa. C. Zespól drżenie - oczoplšs - owrzodzenie. II. Choroba wrzodowa żolšdka. #III. Choroba żolšdka i dwunastnicy. IV.Choroba wrzodowa dwunastnicy z podwyższonym poziomem pepsynogenu I we krwi. A. Z niepodwyższonyzn poziomem gastryny we krwi po spożyciu posilku. B. Ze wzrostem poziomu gastryny we krwi po spożyciu posilku. #'. Choroba wrzodowa dwunastnicy z prawidlowym poziomem pepsynogenu I we krwi. A. Z powolnym opróżnianiem żolšdka. B, Z szybkim opróżnianiem żo#šdka. VI.Choroba wrzodowa dwunastnicy wieku dziecięcego. VII. Postać immunologiczna choroby wrzodowej dwunastnicy. JIII. Choroba wrzodowa skojarzona z innymi chorobami przewleklymi. A. Choroba wrzodowa i przewlekla choroba pluc (częœE z nich wywołana przez defekt a-1-antytrypsyny). B. Choroba wrzodowa dwunastniey i kamica nerkowa. C. Choroba wrzodowa dwunastnicy i choroba wieńcowa. Innym przykładem poszukiwania niejednorodnoœci w zaburzeniach jest #współczesna analiza cukrzycy. Proponowano bardzo rozmaite modele przeka#zywania genetyeznego w cukrzycy żaden z nich nie byl jednak w pelni zadowalajšcy. W miarę postępu badań nad patogenezš tego zaburzenia wyróżniano kilka typów choroby, wœród nich cukrzycę insulinozależnš i in#sulinoniezależnš. W cukrzycy insulinozależnej można prawdopodobnie wyróżnić typy uwarunkowane jednogenowo, wykazujšce wyraŸnie skojarzenie z cechami zgodnoœci tkankowej. Tę niejednorodnoœć potwierdzajš badania prowadzone z zastosowaniem analizy DNA. W częœci przypadków tego zaburzenia mogš również odgrywać rolę czynniki œrodowiskowe, m.in. takie jak przebyte zakażeůnie wirusem Coxsackie. W typie insulinoniezależnym wyróżniano niedawno postać uwarunkowan# jednogenowo (autosomalna dominujšca), tzw. cukrzyca młodych ludzi z poczštkiem w wieku dojrzewania. Inne postacie cukrzycy insulinoniezależnej, :najczęœciej z poczštkiem w wieku póŸniejszym, również wykazujš tendencję do występowania rodzinnego, nie udało się jednak wykazać dokładnie typu dziedziczenia. Dawniej sšdzono, że jest to cecha autosomalna recesywna o niskiej penetracji, dziœ raczej sšdzimy, że jest to zaburzenie uwarunkowane -wieloczynnikowo, być może zresztš niejednorodne. Innym przykładem na rolę zaburzeń jednogenowych w chorobie traktowanej jako wieloczynnikowa może być jedna z postaci dwubiegunowej choroby afektywnej, czyli psychoza maniakalno- depresyjna. Badania przeprowadzone ostatnio, 1987 r., na grupie amerykańskich menonitów (Amish), żyjšcych w izolacie kulturowym w częœci stanu Pensylwania, pozwoliły na wyodrębnienie rodzin o częstym występowaniu dwubiegunowej choroby afektywnej. W jednej z takich rodzin wykazano œcisłe sprzężenie między polimorfizmem fragmentów restrykcyjnyeh obejmujšcych gen insuliny ora2 onkogenu komórkowego Ha-ras-1 a występowaniem choroby psychicznej. Sprzężenie to pozwala na lokalizację genu odpowiedzialnego za ten typ psychozy afektywnej w częœci dystalnej krótkiego ramienia chromosomu 11. Jest to cecha dominujšca o niepełnej penetracji (0,63 w wieku lat 30 i powyżej). Ponieważ w tej samej okolicy chromosomu 11 znajduje się gen hydroksylazy tyrozynowej, można 14Z przypuszczać, że to defekt w czynnoœci tego enzymu może być zwišzany z za- burzeniami nastroju. Podane przykłady wskazujš na to, jak skojarzenie analizy genetycznej, klinicznej i biochemicznej może prowadzić do pełniejszej analizy zaburzeńů uwarunkowanych wieloczynnik#wo. PODSUMOWANIE W rozdziale amawia się metody służšce do wskazania roli eynników genetycznych i œrodowiskowych w uwarunkowaniu cechy, nie wskazujšce jednak na tryb uwarunkowania dziedzicznego. Sš to metody badania bliŸništ orazů badania dzieci adoptowanych. Oprócz cech, których występowanie zależy od jednej pary genów (jednogenowych), występujš cechy zależne od wielu czynników, zarówno gene= tycznych (uwarunkowanie wielogenowe) jak i œrodowiskowych. Badanie tyeh# ceeh posługuje się analizš korelacji między poszczególnymi typami krewnych. Uwarunkowanie wieloczynnikowe odgrywa istotnš rolę w determinacji wielu# cech prawidłowych, głównie tzw. cech iloœciowych, a także wielu częstych. chorób i wad. W powstawaniu tych ostatnich mogš mieć znaczenie zjawiska progowe. Przedstawiono modele uwarunkowania wieloczynnikowego chorób: i wad rozwojowych, omówiono zagadnienie niejednorodnoœci tych zaburzeń i dšżnoœć do wyodrębniania spoœród nich zespołów uwarunkowanych jedno- czynnikowo. IX. Cz#nniki genet#czne w patogenezie chorób :lg#acy Wald 'DZIEDZICZNOŒĆ A Œi#ODOWISKO, ICH ROLA W PROCESIE #OWSTAWANIA CHOROBY Każdy proces przebiegajšcy w organizmie jest rezultatem współdziałania czynników genetycznych i œrodowiskowych. Odnosi się to również do procesu chorobowego, tzn. do zaburzeń równowagi między organizmem a œrodowi#skiem. W medycynie wyróżnia się choroby uwarunkowane genetycznie, tzn. załeżne głównie o# czynników dziedzicznych, i choroby wywołane przez czyntniki œrodowiskowe, egzogenne. Podział ten w istocie jest dosyć względny, ponieważ istnieje cała gama przejœć pomiędzy chorobami uwarunkowanymi genetycznie a chorobami zewnštrzpochodnymi. Na rycinie 72 lewš stronę widma zajmujš zaburzenia takie, jak anomalie chromosomalne lub niektóre „efekty przemiany, które w każdych warunkach œrodowiska prowadzš d4 -;.horoby. Gangliozydoza Galakto - Wady GM, zemia Fawizm rozwojowe Alkoholizm Zarrućia Œrodowisko Dziedzicznoœć AnomaliaChorobaCukrzyca Nadciœnienie GruŸlica Urazy chromosomalna Nlilsona ii.yc. 72. Ogólny schemat roli czynników genetycznych i œrodowiskowvch w uwarunicowaniu chorób. Przykładem takiego żaburzenia jest trisomia chromosomu 13 (zesgół Pataua), w którym występuje wiele zaburzeń w istocie niezależnych od wpływów œrodowiskowych. Podobnie jest we wczesnodziecięcej postaci gangliozydozy uogólnionej, w której na skutek braku á- galaktozydazy gromadzi się w oœrod# ko#'u,ym układżie nerwowym i narzšdach wewnętrznych gangliozyd G;#::. Proces ten w zasadzie przebiega niezależnie od warunków œrodowiskowych. Od warunków œrodowiskowych nieco bardziej zależš takie procesy, jak galaktozemia lub choroba Wilsona. W klasycznej galaktozemii #vystępuje defekt urydylilotransferazy galaktozo-1-fosforanowej, enzymu uczestniczšcego w przekształcaniu galaktozy w glukozę. U dzieci dotkniętych tego typu zaburzeniem mleko stanowi Ÿródło ga 144 laktozy i bardzo szybko przy normalnym karmieniu występujš zaburzenia rozwoju, powiększenie wštroby i œledziony, upoœledzenie umysłowe, zaćma. Przy stosowaniu diety bezgalaktozowej opisane zaburzenia mogš nie wystšpić. Zja#visko to wykorzystano w celu zapobiegania występowaniu objawów chorobowych u noworodków z galaktozemiš. Podobnie w chorobie Wilsona (zwyrodnieniu wštrobowo- soczewkowym)wskzttek zaburzeń w przemianie miedzi - odkłada się ona w narzšdach wewnętrznych i w mózgu. Wyłšczenie miedzi z diety lub wzmożone usuwanie jej z organizmu prowadzi do zahamowania procesu chorobowego. To właœnie jest podstawš postępowania zapobiegawezo- leczniczego w tej chorobie. Podobne zjawisko zachodzi w przypadku fawizmu. Jest to zaburzenie po= legajšce na występowaniu niedokrwistoœci hemolitycznej po spożyciu bobu VŸeża faba. Występuje ono zwłaszeza w krajach wsehodniej ezęœci basenu Morza Sródziemnego. Okazało się, że sš to objawy występujšce u osób z niedoborem dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej. Czynni'kiem powodujšcym zaburzenie jest właœnie bób. Zbliżone zjawisko występuje w porfirii ostrej przerywanej, w której defekt syntazy uroporfobilinogenowej jest cechš stałš, ale choroba objawia się dopiero wskutek zadziałania rozmaitego typu œzkodliwoœci, np. zażycia niektóryeh leków, zwłaszeza z grupy sulfonów i barbituranów (patrz rozdział XIII - Farmakogenetyka i ekogenetyka). W wielu proeesach chorobowych rolę patogenetycznš odgrywajš zarówno czynniki genetyezne, jak i œrodowiskowe. Do zaburzeń tal#ch zali#a się rozrnaitego typu wady rozwojowe (np. wady cewy nerwowej lub serca). Zalicza się do #nich rówńież różne częste choroby, jak cukrzyca, miażdżyca, nadciœnienie i inne. W zaburzeniach traktowanych tradycyjnie jako egzogenne czynniki genetyczne m#gš odgrywać istotnš rolę. Tak np. przewlekły nieżyt oskrzeli, zwłaa szeza u osób palšcych lub przebywajšcych w zanieczyszezonej atmosferze często prowadzi do rozedmy płuc. Skłonnoœć ta jest szezególnie wyraŸna u osób homozygotycznych co do defektu cx-1- antytrypsyny, u których wpływ szkodliwoœci zewnętrznych jest znacrnie większy. Innym przykładem takiej zależnoœci może być występowanie zespołu Werniekego i Korsakowa, encefalopatii wywołanej hipowitaminozš B#, najezęœciej u os„b nałogowo pijšcych alkohol. Zespół uchodzi za jedno z najcięższych powłkłań neurologicznych nadużywania etanolu. Istniejš dane, które wskazujš na to, że zespół ten znacznie częœciej występuje u osób z nieprawidłowš czynnoœciš enzymu transketolazy. U osób tych wzrasta zapotrzebowanie na witaminę Bi. Również w podatnoœci na choroby zakaŸne odgrywa rolę podłoże genetyczne. Istotnš rolę czynników genetycznych wykazano m.in. w gruŸlicy. Na prawym końcu widma znajdujš się ciężkie urazy lub zatrucia, które prowadzš do zahurzeń w organizmie bez względu na konstytucję genetycznš ustroju. Należy zauważyć, że ten sam typ zaburzenia w zależnoœci od charakterystyki organizmu może mieE charakter endo- lub egzogenny. Tak np. gnilec jest u ezłowieka przykładem zaburzenia zewnštrzpochodnego, ponieważ wywołaziy jes# niedoborem witaminy C w pokarmie. Dzieje się tak dlatego, że człowiek nie ma zdolnoœci syntetyzowania kwasu askorbinowego. U gatunków, takich jak szezur lub pies, u których czynny jest tor przemian od glukozy do kwasu askorbinowego, wystšpienie awitaminozy C byłoby skutkiem wrodzonego defektu przemiany. t0 - Zarys genetyki 145 POZIOMY ANALIZY CHORÓB GENETYCZNYCH Podstawš choroby uwarunkowanej genetycznie jest zmiana w składzie zasad azotowych w DNA chromosomu jšdra komórkowego, która może doprowadzić do zaburzenia syntezy odpowiednich bia;łek. Jak wiadomo, zmianę takš nazywa się mutacjš. Ze względu na zdegenerowany charakter kodu genetycznego 64 kombinacjom trójek żasad azotowych odpowia#a tylko 20 aminokwasów, ok. #/n mtacji może nie znaleŸć żadnego wyrazu w #yntetyzowanym białku. Mutacje takie noszš nazwę mutacji synońimianych. Tylko w 1/s przypadków mutacja prowadzi do żmiany #kładu syntetyzowanego białka. W takich przypadkach mogš powstawać białka o zmieńionej funkcji. Zaburzenia tego rodzaju noszš nazwę chorób molekularnych. Dotyczš one białek strukturalnyeh (zaburzenia w strukturze kolagenu), czynnoœciowych (np. hemoglobinopatii) oraz enzymatycznych. W tym ostatnim przypadku powstajš zabuizenia zwane błędami przemiany materii iub blokami metabolicznymi. Przyjmuje się, że choroby izwarunkowane genetyanie zależš nd błędów w zapisie genetycznym kwasów nu!kleinowych i zwišzanych z #tym defektów w syntezie okreœlonego białka, c# z kalei prowadzi do rozmaitego rodzaju zaburzeń strukturalnych i czynnoœciowych. Jednakże w obecnym stanie wiedzy w nielicznych tylko przypadkach jesteœmy w stanie okreœlić produkt nieprawidłowego genu i dlatego ocena i klaisyfikacja genetyczna chorób dziedzicznych opiera się nie na przeœledzeńiu łańcucha biachemicznego zmian zdeterminowanych zmianami w kwasach nukleinowych, lecz na ocenie odległych efektów działańia genu, tzn. na obrazie klinicznym, obrazie morfologicznym, danych elektrofizjologieznych, analizie genetycznej itd. W znacznej większ#œci chorób genetycznych lekarz działa na poziomie I. Wprowadzenie metod biologii molekularnej pozwoliło na znaczne pogłębienie analizy zaburzeń i zstšpieńie do głębœzych poziomów analizy. Postęp w metodach analizy DNA pozwala obecnie niekiedy na przechodzeńie bezpoœrednio od poziomu I do poziomu VI. Znamy obecnie wiele chorób, w których pomimo braku informacji o pierwotnym defekcie genu można zidentyfikować gen chorobowy albo wykorzystywać do diagnoshyki znajomoœć najbliższego sšsiedztwa genu. Dotyczy to np. chor„b, jak: plšsawica Hunting'tona, #ystrofia mięœniowa Duchenne'a lub dystrofia mięœniowa Beckera, osteogenosis i#rcperfecta, ret„#oblasto#n.a i wiele innych. Zastosowanie technik analizy DNA pozwala również na głębsze poznanie tych zaburzeń, w których pierwotny efekt genu jest znany. Dotyczy to np. hem- oglobinopatii oraz wielu defektów metabolicznych. Wprowadzenie technik DNA pozwoliło na rozwój podejœcia zwanego genetykš odwrotnš. Polega on# na izolacji genu, uzyskiwaniu pradurktu białko T a b e 1 a 32. Poziomy anałizy zaburzeń uwarunkowanych genetyeznie Poziom # Rodzaj analizy I analiza kliniczna, patogenetyczna i analiza typu przekazywania dziedzicznego 11 identyfikacja nieprawidłowego toru przemiany III identyfikacja nieprawidłowego białka enzymatycznego IV identyfikacja łańcucha peptydowego, w którym występuje zaburzenie V identyfikacja substytucji aminokwasowej (w przypadku mutacji punktowej) VI identyfikacja zmiany w DNA 146 wego genu i w ten sposób poznaniu mechanizmów patogennych. Podejœcie to stosuje się między innymi do poznania funkcji białka syntetyzowanego pod kontrolš genu dystrofii mięœniowej Duchenne'a. Podobnie udało się scharakte- ryzować defektywne białko powstajšce w uwarunkowanej genetycznie prze- wlekłej chorobie żiarniczej. PATOLOGIA MOLEKULARNA - HEMOGLOBINOPATIE Samo poję„e patologii molekularnej, choroby molekularnej, powstało w 1949 r., kiedy Pauling wykazał różnice w elektroforezie między hemoglobinš A a hemoglobinš S - substancjš odpowiedzialnš za występowanie niedokrwistoœci sierpowatokrwinkowej. Dalsze badańia wykazały, że hemoglobina S różni się od hemoglobiny A tylko jednš substancjš aminokwasowšw pozycji œzóstej łańcucha globiny (3 zamiast kwasu glutaminowego występuje walina. áalsze badania nad hemoglobinopatiaxni dały podstawy do współczesnego rozumienia zaburzeń molekularnych w chorobach dziedzicznych i pozwoliły na analizę tych zaburzeń na poziomie V i VI. Hemoglobina człowieka jest tetramerem, każda jej czšsteczka składa się z 4 łańcuchów polipeptydowych. Głównš hemoglobinš u dorosłych i dzieci jest hemoglobina A - HbA. Składa się ona z dwóch łańcuchów a i dwóch łańcuchów [3 (ap #z). ioo k 80 ## o ## # 60 d 40 i0 I ,c Miesiqce 2 4 Przed urodzeniem po urodzeniu Ryc. 73. Rozwój ontogenetyczny łańcuchów hemoglobiny człowieka w życiu płodowym i w pierwszych miesišcach po urodzeniu. Przerywana linia pionowa wskazuje moment urodzeńia. Ponadto u dorosłych od 2 do 3o/o hemoglobiny stanowi HbAz (a28z). U płodu przeważa hemoglobina płodowa HbF (a2 #2). Niewielkie iloœci HbF występuja również w życiu pozałonowym. We wczesnym okresie rozwoju zarodka w organizmie powstajš również i inne łańcuchy hemoglobiny a mianowicie # i #. Znikajš one z organizmu mniej więcej po 10 tygodniaeh życia zarodka. 147 G,r a - a ;% Gen globiny t A Gra-aBb Łańcuch globiny 5 2á2a;h #9 2 aGl2 Portland Gower 1 Gow'er 2 # Ryc. 94. Układ łańcuchów globinowych w normalnych hemoglobinach człowieka. Kole noœć syntezy rozmaitych łańcuchów w zależnoœci od wieku przedstawia rycina 73. Łańcuch a występuje w HbA, HbAz i HbF. Łań#chy 'Y występujš w organizmie w dwóch wariantach. W jednym z nieh na pozycji 136 w stępuje alanina (A#), w d#<#gim z nich w pozycji tej występuje glicyna (G'y)Rycina 74 przedstawia różne warianty normalnej hemoglobiny, występujšce u człowieka w różnych okresach rozwoju i schemat żch łańcuchów polipeptydowych. Niektóre hemoglobiny występujš u człowieka w postaci podwójnej Ryc. 75. Schemat ewolucji łańcuchów hemoglobiny człowieka. Czas liczy się wstecz od czasów obecnych. Przyjmuje się, że duplikacja dotyczy genu #, który, jak wspominaliœmy wyżej, może wystšpić w dwóch odmianach: A'y i G#r. Dotyczy ona również locus cc. VViadomo, że geny globiny u i # znajdujš się w różnych chromosomach, #en # w ehromosomie 11, gen u w chromosomie 16. Rycina 75 przedstawia sehemat ewolucji łańcuchów globinowych. Warianty hemoglobiny mogš być wynikiem różnych typów mutacji. #'iutacje punktowe - znamy ich obecnie ok. 250 - mogš dotaczyć zarówno lańcucha a, jak i łańcucha #,. Częœć z nich nie ma znaczenia klinicznego, w niektórych jednak dochodzi do znacznych zaburzeń. Może wystšpićniedokrwistoœć hemolityczna spowodowana przez nietrwałoœć hemoglobin jok. 70 wariantów), erytrocytoza spowodowana zwiększonym powinowactwem do tlenu (ok. 20 wariantów), niedokrwistoœć sierpowatokrwinkowa, methemoglobinemia, czyli HbM (5 wariantów). Methemoglobinemia może być wywołana nie tylko przez hemoglobinopatig, lecz także przez defekt enzymaty#zny. Niedobór reduktazy hemoglobinowej przekazywany jako cecha recesywna również prowadzi do methemoglobinemii. Opróez mutacji punktowych występujš i inne typy mutacji. Przedłużenie łańcucha poligeptydowego. Łańcuch a-globiny składa się z I#I #:minokwasów. Trójkš warunkujšcš pozycję aminokwasowš 142 jest U:#A, która koduje zakońezenie syntezy. W wyniku mutacji punktowej UAA może przejœć w CAA. Powstaje wtedy wariant hemoglobiny, który jest dłuższy od łańcueha cc o 31 aminokwasów, tzw. Hb Constant- Spring. Synteza eišgnie się dopótv, dopóki nie dojdzie do następnego trypletu terminalnego. Znane sš również inne hemoglobiny o przedłużonym łańcuchu u. Del#eje. Delecje mogš dotyczyć całego genu globinowego, występuje wtedy zesi,ół znany poc3 nazwš talassemii. Dotyczyć mogš również jednego lub kilku trypletów, a nawet liezby zasad mniejszej niż 3. Dochodzi wtedy do "przesunięcia w fażie" zapisu genetycznego i zmiany całej następnej sekweneji aminokwasów. Mutacje takie prowadzš najezęœciej do nietrwałoœci hemoglobiny lub jej nieprawidłowego powinowactwa do tlenu. Delecja odgrywa ró#vnież rolg w powstawaniu Hb Lepore (patrz niżej). Duplikacje. Zjawisko to może dotyczyć poszezególnych trypletów. Przykładem tego jest hemoglobina a Grady, w której reszty 116-118 uległy duplikacji. Innš odmianš mechanizmu mutacyjnego jest ńierówny crossing-over. Przykładem tego jest Hb Lepore, powstała wskutek nierównego crossing-over i fuzji łańcucha (3 i łańcucha Ó (ryc. 76). Niekiedy wariant może polegać na wtršceniu dodatkowyeh zasad. Ryc. 76. Sehemat powstania # hemoglobiny Lepore w wyniku nierównego crossing-over łańeuchów S- i (i-hemocI- # I Lepore ) globiny. Tal#ssemie stanowiš grupę hemoglobinopatii, w których występuje brak lub znaczne zmniejszenie syntezy jednego z łańcuchów hemoglobin. Jeżeli zaburzenie dotyczy syntezy łańcucha a, to mówimy o a-talassemiach. W normie czlowiek ma 4 egzemplarze genu a-globiny - po 2 w krótkim ramieniu 149 każdego z chromosomów 16 (ua/c##), jeœli delecja dotyczy jednego genu (-u%uu), jest bezobjawowa. Niedabór dwóch genów a wystšpić może w dwóch formaeh (--/ua), nosi nazwę heterozygotycznoœci dla u- talassemii-1 i jest klinicznie bezobjawowy, natomiast w badaniu morfologicznym występuje nieznaczna niedobarwliwa niedokrwistoœć mikrocytarna. U niemowlšt z tym zespołem ezęœciowo występuje HbH (f34). Brak dwóch genów występować może również pod postaciš homozygotycznoœci cechy u-talassemii-2 (#a./-a). Cecha ta klinicznie nie różni się od heterozygot z a-talassemiš-1. Jeœli brak 3 genów a, występuje zespół HbH. W przypadku braku 4 genów i; (--/--) powstaje hemoglobina Bart o budowie Hb#,,4. W tym zaburzeniu występuje uogólniony obrzęk płodu, dzieci na ogół rodzš się martwe. Niekiedy talassemii mogš towarzyszyć inne nieprawidłowoœci, np. hemoglobina Constant-Spring. /i-talassemia polega na zaburzeniu syntezy łańcucha #. W (3-0-talassemii łańcuchy f5 w ogóle nie sš syntetyzowane, w #-talassemii dochodzi do znacznego zmniejszenia ich produkeji. Innym typem talassemii jest Ó-á-talassemia. Występuje w niej zaburzenie syntezy zarówno łańcuchów Ó, jak i (i. Zbliżonym zaburzeniem jest przetrwanie hemoglobiny płodowej. Może ona występować w różnych postaciach, w każdym bšdŸ razie w zespołach tych nie ma syntezy HbA i HbAz, kontynuowana jest natomiast synteza Hba2#2, czyli HbF. T a h e 1 a 33. Hemoglobinopatie o znaczeniu klinicznym (wg Vogela i Motulsky'ego) Zespół kliniczny Zespoły sierpowatoœei n-talassemie á-talassemie Nietrwała hemoglobina Hemoglobiny o nieprawidłowym powinowactwie do tlenu Hemoglobina M niedokrwistoœć sierpowatokrwinkowa sierpowatoœćá-talassemia sierpowatoœćHb C cecha siezpawatoœć obrzęk płodowy (Hb Bart) Hb H heterozygota cc-tal-1 heterozygota a- tal-2 á-thalasse#n.ża nzażor (anemia Cooleya) Hb Lepore heterozygota cecha á wrodzona niesferocytarna niedokrwistoœć hemolityczna z ciałkami Heinza erytrocytoza rodzinna (zwiększone powinowactwo do tlenLz) sinica rodzinna Charakterystyka Ciężkoœć zeœpołu genetyczna homozygota HbS/HbS heterazygota złożona, HbS/á-tal ! heterozygota złożona HbS/HbC heterozygota HbS/HbA 4 deleeje Hb# 3 delecje Hba 2 delecje Hba 1 delecja Hba homozygota fuz,ja genu #-á - heterozygota heterozygoty (ok. 70 odmian) heterozygoty (ok. 30 odmian) heterozygoty (5 odmian) -# do -f- -f0 letalny 0 150 Dotšd mówiliœmy o rozmaitego typu zaburzeniach w syntezie hemoglobin, tak jakby DNA kodujšcy odpowiednie białka miał charakter cišgły. Wiadomo obecnie, że sprawa jest fl wiele bardziej skomplikowana. Obok bowiem częœci DNA, które znajdujš ekspresję w łańcuchu białkowym (egzony), istniejš częœci, które ulegajš transkrypeji tylko do stadium pre-mRNA i nie podlegajš translacji ńa łańcuch polipeptydowy (introny). Mutacje mogš równiPż zachodzić w intronach i wtórnie prowadzić do zmiany składu egzonów, co stwarza dodatkowo mechanizmy powstawania wariantów hemoglobinowych. Delecja lub wtršcenie zasad zmienia bowiem liczbę zasad w intronie i prowadzi do "przesunięcia w fazie" w odezycie zapisu genetycznego w egzonie. Zaburzenia klińiczne w hemoglobinopatiach mogš powstawać w rozmaity sposób. W hemoglobinie S np. nie ulega w zasadzie zaburzeniu funkeja przenoszenia tlenu, zmniejsza się natomiast wyraŸnie rozpuszezalnoœć nie utlenowanej HbS, co prowadzi do żmiany kœztałtu komórek, ich lizy oraz wielu zmian naczyniowych. W innych przypadkach ulega zaburzeniu trwałoœć hemoglobiny, w innych wreszcie powinowactwo jej do tlenu. Zestawienie ważniejszych pod względem klinicznym hemoglobinopatii przedstawia tabela 33. Wprowadzenie współezesnyeh technik badania genetycznego, takich jak hybrydyzacja DNA oraz zastosowanie enzymów restrykcyjnych, pozwoliło na głębsze poznańie hemoglobinopatii, między innymi pozwoliło na diagnozę prenatalnš niedokrwistoœsi sierpowatokrwinkowej i talassemii. ENZYMY I INN# BIAŁKA Defekt genów kodujšcych białka enzymatyczne prowadzi do zaburzeń z#vanyeh blokami metabolicznymi. Koneepeja ta zostala wprowadzona z poczštkiem XX wieku przez Arehibalda Garroda w jego opisie alkaptonurii i znalazła ogromne zastosowanie w medycynie współezesnej. Znamy obecnie wiele zaburzeń powstajšcych w ten sposób. Sehemat powstawania bloku metabolicznego przedstawia rycina 77. Gen a p # Gen a Enzym a b c Enzym #---C Metabol it A --# g =. C -#-. D Metabolit A --łg -, C # D #C CC Ryc. 77. Sehemat powœtawania bloku metabolicznego: a - sehemat uwarunkowanla genetycznego enzymów okreœlonego toru metabolicznego; b - zaburzenia powstałe w wyniku nieprawddłowej czynnoœci genu y. Wadliwa czynnoœć enzymu C może się przejawiać zmniejszeniem iloœci #roduktu D, gromadzeniem się substratu C, wydalaniem się substratu C i jego metabolitów oraz oddziaływaniem zwrotnym gromadzšcego się substratu C na poprzednie ogniwa przemiany. Defekt enzymu może prowadzie do bardzo rozmaitych skutków: do braku produktu procesu enzymatycznego. Przykładem tego typu bloku metabolicznego jest albinizm, w którym wskutek defektu tyrozynazy zaburzona jest synteza melaniny. Dalszym skutkiem bloku metabolicznego może być gromadzenie się substratu. Przykladami takiego zaburzenia sš liczne spichrzowice, np. choroba Taya i Saehsa, w której wskutek braku heksozoaminidazy A gromadzi się gangliozyd GMZ. 151 Innym skutkiem gromadzenia się substratu może być wydalanie z organizmu wzn'zożonych jego iloœci lub jego metabolitów, które w normalnych warunkach zostałyby włšczone do prawidłowych przemian w organizmie. Przykładem tego jest fenyloketonuria, w której wskutek braku hydroksylazy fenyloalaninowej* gromadzi się w organizmie fenyloalanina. W moczu stwierdza si4 również fenyloalaninę, której normalnie się tam nie wykrywa. W moczu występujš również takie zwišzki, jak kwas fenylopiro#ronowy, fenyloetylooctowy i fenyloacetyloglutamina. Typy zaburzeń enzymatycznych bywajš rozmaite. W niektórych z nich nie powstaje w ogóle białko enzymatyczne, w innych białko enzymatyczne może zostać wykryte za pomocš badań immunologicznych. Niekiedy enzym jest produkowany, zachowana może być częœciowo jego aktywnoœe, zmienia si# natozniast jego trwałoœć. Bywa tak w niektórych postaciach akatalazji i w niektórych postaciach zespołu Lescha i Nyhana. lnne typy zaburzenia mogš polegać na zmianie powinowactwa enzymu do substratu, na zmianie zapotrzebowania na koenzym itd. Tak np. znane sš przypadki choroby syropu klonowego (leucynozy), w których objawy ustępujš po podaniu dużych dawek tiaminy. Zapotrzebowanie na pirydoksynę jest zwiększone w przypadkach wielu chorób, m.in. niektórych postaci homocystynurii. W niektórych postaciach acydLzrii metylomalonowej skutkuje podawanie cyjanokobalaminy (witaminy B,#). Jednym ze skutków uwarunkowanego #enetycznie defektu enzymatycznego mogš być wtórne bloki metaboliczne. Mechanizm ich bywa rozmaity. Tak np. wzrost stężenia substratu G może spowodować bšdŸ zahamowanie aktywnoœci enzymu w poprzednich ogniwach przemiany, bšdŸ też gromadzšcy się substrat może działać jak reprcsor, tzn. hamować syntezę innego enzymu. Nżekiedy wtórnym efektem pie:wotnego bloku metabolicznego może być zwiekszenie aktywnoœci innego enzymu. Tak np. w porfir ostrej przerywanej, spowodowanej defektem syntazy urobilinogenowej, zwiększona jest aktywnoœć syntazy kwasu 8- aminolewulinowego i iloœć tego kwasu w moczu jest wyraŸnie zwiększona. Na ogół pierwotny defekt genu zgodnie z podstawowym parady#matem genetyki molekularnej prowadzi do defektu tylko jednego enzymu. Znane sš jednak bloki metaboliczne, w których defekt jednego genu prowadzi do defektu dwóch lub więcej enzymów. Jeœli wyłšczymy vr takich przypadkach możliwoœć, żeby defekt drugiego enzymu był zjawiskiem wtórnym, to najczeœciej mechanizm tego zjawiska polega na tym, że upoœledzeniu ulega eiement wspólny dla kilku enzymów. Tak np. bywa we wspomnianej wyżej chorobie syropu klonowego **, w której defekt dotyczy oksydazy ketokwasów rozgałęzionych, tzn. leucyny, izoleucyny i waliny. Dawniej sšdzono, że jest to jeden enzym o powinowactwie do wszystkich trzech substratów. Obecnie sšdzimy raczej, że enzym ten składa się z dwóch podjednostek, pierwsza z nic:z jest wspólna dla wszystkich trzech substratów, druga zaœ nadaje im swoistoœć. W chorobie syropu klonowego dochodzi do defektu polipeptydz.z wspólnego. Podobne zjawisko zachodzi najprawdopodobniej w postaci Sandhoffa ganglinzvdozy GM2, gdzie - odmiennie od postaei Taya i Sachsa, w której stwierdza sżę tylko defekt heksozoaminidazy A - stwierdza się zarówno defekt heksozoaminidazy A, jak heksozoaminidazy B. Przypuszcza się, że w poœtaci Sandhoffa upoœledzony jest łańcuch polipeptydowy wspólny dla obu * Inna nazwa enzymu to 4-monooksygenaza. ** Nazwa pochodzi od charakterystycznego zapachu moczu. 152 heksozoaminidaz. Podobne zjawisko zachodzi prawdopodobnie w acydurii orotowej, w której występuje defekt dwóch enzymów: pirofosforylazy i dekarboksylazy orotydyno-5-fosforanowej. Znamy obecnie ponad 150 wrodzonych d#fektów metabolizmu. Przedstawimy przykłady niektórych z nich. Klasycznym przykładem defektów metabolicznych, który w pewnym sensie stał się modelem naszego postępowania w tego typu zaburzeniach, jest fenylohetonuria. Jest to zaburzenie charakteryzujšce się zwiększonš zawartoœciš fenyloalaniny we krwi oraz wydalaniem fenyloalaniny i niektórych jej pochodnych, m.in. fenyloketonów, z moczem. Jest to choroba autosomalna recesywna, dzieci homozygoty przychodzš na œwiat bez szczególnych zaburzeń, w cišgu pierwszych szeœciu miesięcy życia jednak zaznacza się wyraŸne zahamowanie rozwoju, w wieku 4 - 5 lat ogromna większoœć #horych jest głęboko upoœledzona umysłowo (iloraz inteligencji 20). Somatycznie chorzy wykazujš nieznaczne upoœledzenie rozwoju, obwód głowy jest z reguły poniżej normy. Chorzy wykazujš charakterystyczne zaburzenia barwnikowe - skóra jest jasna z tendencjš do wyprysku, włosy jasnoblond z odcieniem szarawym. lVlocz i pot majš "mysi zapach" (kwas fenylooctowy). Oprócz upoœledzenia umysłowego stwierdza się wzrost napięcia mięœniowego, wygórowanie odruchów, zaburzenia zachowania typu hiperaktywnoœci ze stereotypiami, nierzadkie sš napady padaczkowe. W niewielkiej li#zbie przypadków (od 2 do 5#/o) osoby z typowymi biochemicznymi objawami choroby mogš być prawidłowo rozwinięte umysłowo. Oprócz fenyloketonur wyróżnia się klinicznie fenyloketonurię matczynš. Jeœli kobieta chora na fenyloketonurię zajdzie w cišżę, to dziecko jej obcišżone jest znacznym ryzykiem upoœledzenia umysłowego, małogłowia oraz różnorodnymi wadaxni koœćca i narzšdów wewnętrznych. Dzieci nie sš chore na fenyloketonurię, sš tylko heterozygotami w stosunku dó tej cechy, natomiast organizm uległ uszkodzeniu wskut#k nadmiaru fenylaalaniny w œrodowisku płodowym. Jak się okazało, defekt metaboliczny w fenyloketonurii polega na upoœledzeniu hydroksylazy fenyloalaninowej przeprowadzajšcej fenyloalaninę w tyrozynę (ryc. 98). Pierwotnym skutkiem defektu genu jest zwiększenie zawartoœei fenyloalaniny w organizmie i zmniejszenie zawartoœci tyrozyny. NAD+ NADH 3 2 0ihydrobiopteryna Reduktaza dihydropterydyn Reduktaza Tetrahydrobiopteryna Chinonoid-dihydrobiopteryna dihydCofolianu NADPH NADP* Hydroksylaza fenyloalaniny # # CHyŃH COOH HO # # CHyŃH COOH Fenyloalanina Tyrozyna Ryc. 79. Różnorodne typy defektów występujšce w f#nyloketonurii: I - fenylaketonur„a klasyczna - defekt hydroksylazy fenyloalaninowej; 2 - defekt reduktezy dihydropt#rydynowej; 3 - defekt reduktazy dihydrofolianowej. 154 Inne zaburzenia, m.in. dotyczšce melaniny, sš przejawem wtórnych bloków metabolicznych. Postęp badań biochemicznych pozwolił na opraeowanie testów przeœiewowych wykrywajšcych fenyloketonurię już u noworodków. Okazalo się również, że wyłšczenie z diety mleka, które jest dla niemowlęcia glównym Ÿródłem fenyloalaniny, i podawanie hydrolizatów bialkowych o małej zawartoœci fenyloalaniny zapobiega występowaniu objawów chorobowycń. Stało się to podstawš do wszczęeia odpowiedniego postępowania zapobiegawczego. ##'prowadzenie masowych badań noworodków w kierunku zwiększonej zawartoœci fenyloalaniny we krwi pozwoliło na wykrycie, oprócz klasycznej fenyloketonurii, również irmych postaci hiperfenyloalaninemii. W jednej z nich T a b e I a 34. Obraz kliniczny sfingolipidoz Defektywny enzym Nazwa choroby # Spichrzana substancja, objawy kliniczne á-galaktozydaza gangliozydoza uogólniona Heksozoamini.daza A choroba Taya i Sachsa Heksozoaminidaza hhffa ba SandAi H á-galaktozydaza lak- lipidoza laktotozyloceramidu zyloceramidowa Glukocerebrozydaza choroba Gau- chera Arylosulfataza A á-galaktozydaza galaktocerebrozydowa leukodystrofia metachromatyczna choroba Krabbego * u-galaktozydaza (ceramidotriheksozydaza) Sfingomielinaza Ceramidaza kwaœna choroba Fabry'ego (angżocerato#na corporżs dżffusu7n) choroba Niemanna i Picka lipogr anulomatoza (choroba Farbera) gangliozyd GM1, w p#staci klinicznej; poczštek w wieku niemowlęcym; postępujšca regresja neurologiczna, hepatosplenomegalia, zmiany kostne gangliozyd GM (w układzie nerwowym); poczštek w 4 - 6 miesišcu życia; postępujšca regresja neurologiczna, œlepota, padaezka gangliozyd Gnzz w układzie nerwowym, globozyd w narzšdach wewnętrznych; obraz kliniczny jak w chorobie Taya i Sachsa laktozyloceramid w mózgu i narzšdach wewnętrZnych glukocerebrozyd w narzšdach wewnętrznych, w niektórych formach i w układzie nerwowym; poczštek zależny od postaci; hepatosplenomegalia, w postaci dziecięcej również i objawy mózgowe sulfatyd w układzie nerwowym; postępujšce zwyrodnienie układu nerwowego galaktocerebrozyd w układzie nerwowym; poczštek w niemowlęctwie - szybka regresja neurologiczna ceramidotriheksozyd w układzie nerwowym i narzšdach wewnętrznych; zespół recesywny sprzężony z chromosomem X; postępujšce zaburzenia skórne, nerkowe, naczyniowe i neurologiczne sfingomielina w narzšdach wewnętrznych; a w niektórych postaciach także w układzie nerw4wym; hepatosplenomegalia, w niektórych formach objawy neurologiczne ceramid, postępujšce zmiany skórne, stawowe, objawy neurologiczne * Wszystkie wymienione zespoły, z wyjštkiem choroby Fabry'ego, dziedziczš się jako cecha autosomalna recesywna. Ryc. 80. Bloki metaboliczne w sfingolipidozach: a - ceram;d, b - schemat bloków metabolicznych w sfingolipidozach. # Glk # Gal # NA# # Gal rangfiozyd GM# Cer Ga GcnSliozydczc # uogólniona NAcNA á Glk # Gal # NAc angliazyd GM2 Cer Choroba Tayc i Sachsa N Ac P# A -r # Glk al Laktozyloceramid C2r # Lipidoza laktozy:o#eramidu Glukozylo#eramid Cer i # Glk lglul:ocerebrozy# i - # Gal œ-sicrczan galaktozylo= Cer #eramldu Isulfatyd ) 0503 alcktozyloceramid Cer á Gal ;aciaktocerebrozyd) ietraheksozyloceramid Cer f Glk á Gal Gal Sfingomielina Cer #C#ol ;cercmido -fosfocholina) Ceramid Cer Cer - cercmid (N - acylosfingozyna) Glk - gfukoza Gaf - galaktozo PChol - fosfocholina NAcNA - kwas N-acetyloneuraminowy NAcGal - N- acetylogalaktozoamina Choroba :#auchera Leukody5trofic metachromatycznc Choroba Krcbbego Choroba Fabry'ego Choroba Niemcnr.c i aicka Charoba Fcrbera defekt dotyczy enzymów wspóldziałajšcych z hydroksylazš fenyloalaninowš ' (ry#. 79), w innej hiperfenyloalaninemia ma charakter przemijajšcy i może zależeć od upoœledzenia funkcji innych enzymów, np. transaminazy fenyloalaninowej lub opóŸnionego dojrzewania hydroksylazy. * Inna nazwa enzymu to 4-monooksygenaza fenyloalaninowa. x5s Fenyloketonuria należy do bloków enzymatycznych dotyczšcych aminokwa- sów. Innš dużš kategorię bloków metabolicznych stanowiš te, w których zabu- rzeniu ulega aktywnoœć enzymów występujšcych głównie w lizosomach, orga- nellach komórkowych, odgrywajšcyeh istotnš rolę w katabolizmie tłuszezów i polisacharydów. Tu przedstawimy grupę bloków metabolicznych należšcych do tej kategorii, a mianowicie sfingolipidozy. Defekty te przedstawione sš na rycime 80. Tabela 34 przedstawia zestawienie objawów klinicznych w tych chorobach. Odmiennie niż w fenyloketonurii, możliwoœci postępowania leczni- czego sš ograniczone, w chorobach tych natomiast możliwa jest diagnostyka prenatalna. Na tym też opiera się głównie postępowanie zapobiegaweze. Ogromna większoœe bloków metabolicznych dziedziczy się w sposób rece- sywny. Z ważniejszych defektów metabolicznych sprzężonych z chromoso- mem X należy wymienić zespół Leseha i Nyhana, spowodowany niedoborem fosforybozylotransferazy hipoksantyny i guaniny, zespół Huntera - muko- polisacharydoza typu II spowodowana defektem sulfatazy siarezanu idurenido- wego. oraz chorobę Fabry'ego - niedobór a-D- galaktozydazy, Recesywny charakter defektów przemiany tłumaczy się tym, że ogromna większoœć blo- ków dotyczy funkeji enzymów katalitycznych. Funkeje te zaœ w procesie ewo- lucji rozwinęły się prawdopodobnie tak, by enzym mógł działać z rezerwš, tzn. by u heterozygoty nie występowały zaburzenia. Jednym z nielicznych wy- jštków od tej zasady sš różne postacie porfir przekazujšce się jako zaburze- nia autosomalne dominujšce. Dominujšce zaburzenia typu metabolicznego częœciej występujš przy innego typu zaburzeniach białkowych. Przykładem tego jest hipereholesterolexnia ro- dzinna, w której zaburzenia występujš u heterozygot. Osoby takie wykazujš zwiększone stężenie cholesterolu i skłonnoœć do choroby wieńcowej między trzeciš a szóstš dekadš życia. Homozygoty co d# tej cechy majš niezwykle duże stężeńie cholesterolu, powyżej 800 mg na 100 ml i objawy wieńcowe mogš występować już w wieku dziecięcym. Najezęœciej homozygoty #inš z tego powodu poniżej 30 roku życia. Przypuszeza się, że mechanizm chorobowy po- lega na braku lub defekcie receptorów wišżšeych lipoproteiny o małej gęsto- œci (LDL). Ze względu na to zwiększa się zawartoœć lipoprotein w osoczu a także stężenie cholesterolu. Wiadomo obecnie, że istnieje zna#na różnorod- noœć mutaeji powodujšcych hipereholesterolemię. Dlatego wiele spoœród osób uważanych dotšd za homozygoty może być w rzeczywistoœci złożonymi hetero- zygotami. Inny typ zaburzeń może wystšpić przy defektach dotyczšcych różnego ro- dzaju białek strukturalnych. Przypuszeza się, że różne postacie amyloidozy dziedżicznej polegajš np. na powstawańiu nieprawidłowych białek włókien- kowych. W innych defektach białek strukturalnych mogš powstawać zarówno postacie dominujšce, jak i recesywne. Przykładem tego jest rybia łuska (żeh- thyosżs vulgarżs). Powstaje w nich defekt keratohialiny. DEFEKTY STRUKTUIf.ALNE W wielu zaburzeniach genetycznych nie stwierdza œię zaburzeń metabolicznych. które mogłyby odpowiadać za ich powstanie. Rzecz prosta, należy sobie zdawać sprawę, że w wielu zespołaeh, szezególnie charakteryzujšcych się zmianami wstecznymi, niewykry„e defektu metabolicznego nie ożnacza bynajmniej, że tego defektu nie ma. Doœwiadezenia ostatnich dziesięcioleei wskazujš wyraŸnie, że wiele chorób przeszło z kategor chorób zwyrodnieniowych do kategorii chorób metabolicznych. Zaliczyć tutaj można na przykład zwy 157 rodnienie wštrobowo-soczewkowe, mukopolisacharydozy, niektóre postacie leukodystrofii. W wielu chorobach jednak bardzo trudno jest przewidzieć, jaki mógłby być pierwotny produkt genu. Do za'burzeń tego typu należš w szczególnoœci różne defekty strukturalne, takie jak akrocefalosyndaktylia - autosomalno- dominujšey zespół wad rozwojowych, zeœpół Crouzona (również autosomalno-dominujšcy), dyzostoza żuchwowo-twarzowa (autosomalno- dominujšcy zespół Treachera i Collinsa), różne postacie krótkopalczystoœci, wielopalczystoœci, ektrodaktylii itd. Do tej kategorii należš również zespoły z grupy fakomatoz (stwardńienie guzowate, neurofibromatoza i inne). Cechš wspólnš większoœci tych zespołów jest nieprawidłowy rozwój organizmu i ńie można wykluczyć, że doœć paradoksalnie, efekty struktury mogš być wywołane przez defekt re#ulacyjnych mechanizmów genetycznych. W chorobach, w których nie stw5erdza się zaburzeń metabolicznych, ważne znaczenie ma analiza różnych danych klinicznych, m.in. wieku wystšpienia pierwszych objawów choroby. W dawnej genetyce popularne były sšdy, że choroby dziedziczne cechuje skłonnoœć do antepozycji i antycypacji, tzn. do tego, że w następnych pokoleniach wiek poczštku choroby jest wczeœniejszy, a forma cięższa. Zjawisko takie opisywano m.in. w dystrofii miotonicznej. Jak wiadomo obecnie, antycypacja nie jest zjawiskiem biologicznym, ale artefaktem statystycznym i wynika stšd, że chorzy z ciężkš postaciš choraby majš mniejsze szanse posiadania potomstwa aniżeli chorzy z lekkš postaciš. Analiza wieku poczštku choroby może mieć również znaczenie dla oceny jednorodnoœci genetycżnej zespołu. Jeœli bowiem wzišć grupę osób dotkniętych jakšœ chorobš uwarunkowanš genetycznie i badać współczynnik korelacji między wiekiem wystšpienia choroby u rodzeństwa, to można oczekiwać, że jeœli choroba wywołana jest przez jeden gen, to współczynnik będzie wynosił ok. 0,5; jeœli choroba zależy od kilku genów, to wartoœć wspólczynnika korelacji będzie bliska jednoœci. Metoda ta, vcrprowadzona przez Haldane'a, pozwoliła na wykazanie niejednorodnoœci genetycznej niektórych postaci rdzeniowego zaniku mięœni. Wprowadzenie metod analizy DNA stwarza nowe możliwoœci analizy chorób genetycznych, w których występujš defekty strukturalne, w szczególnoœci pozwala na dokł.adne okreœlenie typu mutacji oraz wykrywanie niejednorodnoœci genetycznej w zespole. POST#PY GENETYKI A KLASYFIKACJA CHOftÓB Postępy genetyki, a zwłaszcza postępy genetyki molekularnej, pozwoliły na znaczne wzbogacenie nasżej wiedzy i koncepcji dotyczšcych klasyfikacji. Jednym z charakterystycznych procesów w tej dziedzinie jest rozpad jednorodnych, jak wydawałoby się dotšd, jednostek chorobowych na różne zespoły - innymi słowy - niejednorodnoœć genetyczna uznawanych dotšd za jednorodne chorób. Proces ten występuje we wszystkich dziedzinach medycyny. Tak np. przez wiele lat znano tylko krwawišczkę - sprzężony z chromosomem X defekt krzepnięcia krwi. Obecnie wyróżniamy hemofilię A, wywołanš przez niedobór czynnika VIII i hemofilię B (chorobę Christmasa) spowodowanš przez niedobór czynnika IX. Przez wiele lat sšdzono, że istnieje jednostka chorobowa, zwana idiotyzmem amaurotycznym, charakteryzujšca się spichrzaniem substancji tłuszczowych w oœrodkowym układzie nerwowym. Ze względu na wiek wyróżniano w tej chorobie postać wczesnodziecięcš (Taya i Sachsa), póŸnodziecięcš, młodzieńczš 158 i póŸnš. Okazało się następnie, że przypadki opisywane jako idiotyzm amaurotyczny naprawdę zaliczajš się do trzech różnych typów chorób przemiany. Choroba Taya i Sachsa to gangliozydoza GMz, przypadki traktowane jako najwezeœniejsze zespoły tego typu, to gangliozydoza GM#, postacie póŸne zaœ dotycz# zupełnie innego typu przemiany i zaliczajš się obecnie do eeroidolipofuscynozy. Okazało się następnie, że ehoroba Taya i #achsa nie jest zaburzeniem jednorodnym i można w niej wyróżnić co najmniej 4 odmiany różne pod względem biochemicznym (odmianę A, odmianę 0, odmianę AB i odmianę młodzieńezš). Niekiedy niejednorodnoœć genetyczna może się zaznaczaE nawet przy braku danych o molekularnym charakterze choroby, tak np. w neuralnym zaniku mięœni (chorobie Charcota, Marie i Tootha) wyróżniamy postać autosomalnš dominujšcš, autosomalnš recesywnš i recesywnš sprzężonš z chromosomem X. Sprawę komplikuje jeszeze możliwoœć występowania fenokopii, tzn. zaburzeń o podobnym obrazie klinicznym, ale wywołanych nie czynnikami genetyeznymi, leez głównie przez działanie czynników zewnętrznych. Obok procesu rozpadu, jednorodnych dotšd, jednostek nozologicznych występuje zarazem, choć w znacznie mniejszej skali, proces łš- czenia oddzielnych dotšd zespołów. Tak np. #rzez ługie lata u'znawano oddzielne istnienie stwardnienia rzekomego (pseudoselerosi.s Westphal-Str#n,pell) i postępujšcego zwyrodnienia wštrobowego Wilsona. Następnie okazało się, że jest to jedna choroba charakteryzujšca się zaburzeniem przemiany miedzi. Niekiedy analiza biochemiczna pozwala na łšczenie odmiennych klinicznie postaci zaburzeń. Tak np. wœród mukopolisacharydoz wyróżnian# do niedawna postać I, czyli chorobę Gertrudy Hurler, charakteryzujšcš się upoœledzeniem umysłowym, wadami koœ‚ca, powiększeniem wštroby ż œledziony, wadami innych narzšdów oraz postać V - chorobę Seheiego, bez zaburzeń razwoju umysłowego, z dużymi natomiast zmianami koœ‚ca. Okazało się, że oba zaburzenia wywołane sš defektem tego samego enzymu a-iduronidazy, tyiko w zespole Hurler defekt enzymu jest prawie całkowity, podezas gdy w wariancie Seheiego jego aktywnoœć jest częœciowo zachowana. Podobnie różne postacie defektu tego samego enzymu á-D- galakto2ydazy odpowiadajš za różne kliniczne zaburzenia: wezesnodziecięcš postać gangliozydozy G##, chorobę Morquio B oraz p.owoli #postępujšcš encefalopatię o póŸnym przebiegu. Jeżeli do wiedzy o chorobach jednogenowych dodać postęp wiedzy w klasyfikacji zaburzeń wieloczynnikowych, a także o zaburzeniach chromasomalnych, to będzie widać, jak wiele wnoszš postępy genetyki do klasyfikacji chorób. GENETYKA A NOWOTWORZENIE Znamy różne cechy uwarunkowane jednogenowo, w których występujš guzy nowotworowe lub w których jest znacznie zwiększona skłonnoœć do takich guzów. Przykładami ich mogš być: meurofibromat#za, siatkówezak płodowy, choroba Hippel-Lindaua, zespół skóry pergaminowej barwnikowej (xerodernza pżg#n,etztosum) itd. W ogromnej większoœci częstych nowotworów częstoœć u krewnych probanda na ogół nie odbiega od częstoœci w populacji ogólnej. W ostatnich latach jednak okazało się, że mechanizmy genetyczne mogš odgrywać istotnš rolę w powstawaniu różnych nowotworów. Badania te szły kilkoma torami. Jeden z kierunków polegał na wykazaniu roli mutacji somatycznych w wy 159 stępowaniu nowotworów. Dowiodły tego badania nad siatkówczakiem zarodkowym. Już przed wielu laty wykazano, że w częœci przypadków siatków#zaka dochodzi do delecji w pršżku 14 krótkiego ramienia chromosomu 13. Badania póŸniejsze wykazały, że mikrodefekt chromosomalny występuje częs-to u pacjentów z siatkówczakiem. Zastosowanie metod analizy DNA pozwoliło na wykazanie, że u osób heterozygotycznych dla mutacji przez rekombinację somatycznš komórki siatkówki stajš się homozygotyczne dla genu zmutowanego. Taka homozygotycznoœE może zresztš powstać również i w inny sposób, np. jako skutek nierozłšczenia się chromosomów w procesie mitozy. Inny kierunek badania dotyczył wirusów onkogenicznych, a zwłaszcza retrowirusów zbudowanych z RNA, zawierajšcych odwrotnš transkryptazę RNA oraz przenoszšcych onkogeny, geny odpowiedzialne za przemianę komórek normalnych w nowotworowe. Onkogeny wirusowe (v-onc) wytwarzajš białka o aktywnoœci enzymatycznej kinaz lub czynników wzrostowych. W ostatnich latach okazało się, że w chromosomach ełowieka znajdujš się również onkogeny (c-onc) o bardzo zbliżonej budowie do onkogenów wirusowych. Ońkogeny komórkowe znajdowano w komórkach nowotworowych. Okazało się również, że w komórkach zdrowych znajdujš się zbliżone do onkogenów geny zwane protoonkogenami. Różnica między onkogenami a protoonkogenami może być niewielka. Tak np. stwierdzono, że różnica między protoonkogenem a onkogenem wyizolowanym z komórek raka pęcherza moczowego dotyczy jednego tylko nukleotydu: w pozycji 12 kodowanego pxzez protoonkogen białka występuje glicyna, w nowotworach w pożycji tej występuje walina. Mutacja punktowa może również doprowadzić do aktywizacji onkogenu czyrmego przy powstawaniu niektórych postaci raka płuc. Niekiedy przejœcie z protoonkogenu w onkogen może się #dbyć pod wpływem wirusów włšczajšcych promotorowe sekwencje DNA, aktywujšcych działanie onkogenu. Innym sposobem aktywacji onkogenów jest translokacja chromosomalna. Translokacja taka w przebiegu przewlekłej białaczki szpikowej (chromosom F#ladelfia) przenosi onkogen c-abl z końca ramienia długiego chromosomu 9 na chromosom 22 w sšsiedztwo genu lambda lekkich łańcuchów immunoglobulinowych. Sš dane, że promotory DNA normalnie zwišzane z wytwarzaniem łańcuchów lekkich immunoglobulin uczynniajš onkogen c=nbl. Dokładne mechanizmy molekularne powstania nowotworów nie sš jeszcze znane, widaE jednakże, jakie perspektywy stwarza zastosowanie tych badań w onkologii. POST#PY GENETYKI A DIAGNOSTYKA Uwzględnianie danych genetycznych ma istotne znaczenie dla rozpoznawania chorób. Już na najbardziej powierzchownym poziomie analizy uwzględnianie wywiadu rodzinnego jest ważne dla ustalenia właœciwego rozpoznania. Analiza rodowodów niekiedy pozwala rozstrzygnšć, czy dwa zespoły chorobowe dotyczšee zbliżonych zaburzeń majš charakter alleliczny, czy nie. Analiza genetyczna może się przyczynić do stwierdzenia skojarzenia między chorobš. a znacznikiem genetycznym, bšdŸ też pozwolić na ustalenie sprzężenia między dwoma cechami. Niekiedy ma to nader żstotne znaczenie. Tak np. stwierdzenie sprzężenia między dystrofiš miotonicznš a grupami krwi Se i Lewis pozwala na prenatalnš diagnozę dystrofii miotonicznej. Takie samo znaczeniE ma stwierdzenie sprzężenia między jednš z postaci zaniku oliwkowo-mostowo-mbżdżkowego a HLA. Można przypuszczać, że gdy nasza wiedza na ten temat 160 wzbogaci się, możliwa będzie wczesna diagnostyka i diagnostyka prenatalna wielu zaburzeń typu strukturalnego. Niezwykle istotne znaćzenie ma zastosowanie współczesnych metod biochemicznych do rozpoznawania chorób. Pozwalajš one na znacznie pełniejsze rozpoznanie zaburzenia i jego postaci. W coraz większej liczbie zespołów stosuje się do tej diagnostyki techniki hodowli tkankowej. Poza diagnozš zaburzeń chromosomalnych pozwala ona na głębsze poznanie wielu zaburzeń biochemicznych. W szczególnoœći techniki te majš zastosowanie w rozstrzyganiu, czy dwa podobne zaburzenia mogš ulegać wzajemnej kompensacji. W ho= dowli fibrublastów chorego z mukopolisacharydozš typu I (Hurler) gromadzš się metabolity patologiczne. Podobnie jest w hodowli komórek chorego z mukopolisacharydozš typu II - postaciš Huntera. We wspólnej hodowli oba defekty komórkowe ulegajš kompensacji i nie gromadzš się metabolity patologiczne. Taka komplementacja pozwala również na wykrycie niejednorodnoœci genetycznej w jednolitych, jak się dotšd wydawało, zespołach. Wykazanie takiej komplementacji między komórkami pochodzšcymi od różnych pacjentów z chorobš Sanfilippo pozwoliło na wykrycie postaci A i B tej choroby. Istotne znaczenie w diagnostyce ma analiza asocjacji. Asocjacjš, czyli skojarzeniem, nazywamy występowanie łšcznie dwóch cech częstszych, niżby tn wynikało z przypadkowej koincydencji. Asocjacja może œwiadczyć o zwišzku fizjologicznym między dwoma cechami lub między cechš a chorobš. Przykładem takiego zwišzku może być asocjacja między grupš krwi A a rakiem żołšdka. Ze względu na to, że w tkankach raka żołšdka stwierdzano substancje zbliżone do budowy chemicznej antygenu grupowego A, przypuszćza się, że u osób z tš grupš krwi łatwiej może dochodzić do czegoœ w rodzaju tolerancji immunologicznej w stosunku do nowotworu. Wykaz niektórych asocj acj ż przedstawia tabeia 35. Należy odróżniać asocjację od sprzężenia, tzn. od skojarzenia dwóch cech, wywołanego lokalizacjš ich genów w niewielkiej odległoœći w tym samym chromosomie. Na ogół cechy sprzężone nie wykazujš asocjacji w populacji ogólnej. Stwierdza się natomiast charakterystycznš segregację ich w rodzińie: przekazujš się one bšdŸ łšcznie, bšdŸ rozłšcznie w zależnoœći od tego, czy geny znajdujš się w jednym z chromosomów homologićznych, czy też rozłšcznie. W rzadkich tylko przypadkach sprzężenie jest tak œcisłe, że prowadzi do asocjacji również w populacji ogólnej. Przykładem takiego spxzężenia może być hemochromatoza - choroba autosomalna recesywna, której gen znajduje się w chromosomie 6 w bliskim sšsiedztwie genu HLA. Cecha ta wykazuje asocjację z HLA A3. Tabela 35. Asocjacje między cechami i chorobami Znacznik Choroba Grupa krwi 0 Grupa krwi A Zwiększone stężenie pepsynogenu w osoczu Niewrażliwoœć na smak fenylotiomocznika HLA B27 HLA B27 HLA B27 HLA B8 HLA CW6 IndukowalnoœE hydroksylazy węglowodorów aromatycznych owrzodzenie dwunastnicy rak żołšdka owrzodzenie dwunastnicy wole zesztywniajšce zapalenie kręgów zespół Reitera ostre zapalenie jagodówki choroba trzewna łuszczyca pospolita rak odoskrzelowy płuca 11 - Zarys genetyki Watne znaczenie dla diagnozy genetycznej ma wykrywanie heterozygot. W przypadkach zaburzeń dotyczšcych enzymów najczęœciej stwierdza się efekt dawki i aktywnoœć enzymu heterozygoty wynosi 50#/# aktywńoœci enzymu homozygoty typu dzikiego. W przypadkach, w których nie bada się bezpoœredniego efektu genu, stosunki takie mogš nie zachod#ić i wtedy pomocne bywajš różne próby obcišżeniowe. Próby takie stosuje się m.in. w celu wykry.cia heterozygot dla genu fenyloketonurii. Obcišżenie fenyloalaninš i analiza zachowania się zawartoœci fenyloalaniny i tyrozyny we krwi pozwala w większoœci przypadków na klasyfikację badanych osobników. Do wykrywania mogš być rówńież pomocne techńiki hodowli tkankowej, coraz częœciej stosuje się także w tym celu badanie aktywnoœci enzymów w cebulkach włosowych. Ważne znaczenie dla profilaktyki majš testy przesiewowe. Badania takie stosuje się w populacji, zwłaszcza wtedy, jeœli można wczeœnie wykryć zaburzenie szczególnie ciężkie, któremu potrafimy zapobiec lub możemy je leczyć. W różnych populacjach sš to zaburzenia różne. W Polsce ważne znaczenie ma wykrywanie feny1oketonurii, galaktozemii, niedoczynnoœci tarczycy, w przyszłoœci mukowiscydozy. W populacjach o dużym odsetku ludńoœci murzyńskiej ważne znaczeńie może mieć również stosowanie testów przesiewowyeh w kierunku hemoglobinopatii. W populacji Żydów aszkenazyjskich istotne znaczeńie majš przeglšdy w kieruńku wykryeia choroby Taya i Sachsa. Niekiedy stasuje się testy przesiewowe w celu wykrycia heterozygot. Istniejš doœwiadczenia tego typu z wykrywaniem heterozygot choroby Taya i Sachsa w grupach ludnoœci w Stanach Zjednaczonych. Wykrycie heterozygot pozwala na identyfikację rodzin, w których oboje małżonkowie sš heterozygotami i istnieje ryzyko urodzenia się dziecka dotkniętego ch4robš. Od metod stosowanych jako testy przesiewowe wymaga się spełnienia kilku warunków. Muszš to być metody doœć proste i doœć tanie w stosowaniu, cechować się dużš rzetelńoœciš oraz trafnoœciš, zwłaszcza charakteryzować je musi duża czułoœć, tzn. muszš dawać bardzo niewiele wyników fałszywie ujemnych. Mniej ważna w oceńie testu przesiewowego jest jego swoistoœć, tzn. zdolnoœć do dawania małej liczby wyników fałszywie dodatnich. Na ogół wynik dodatńi w teœcie przesiewowym wymaga potwierdzenia badaniami bardziej wyspecj alizowanymi. Stosowanie testów przesiewowych w wybranych grupach populacyjnych może stwarzać rozmaite problemy typu niemedycznego, tak np. wœród Murzynów amerykańskich w latach siedemdziesištych zrodził się ostry protest przeciwko próbom wprowadzenia testów przesiewowyeh w kierunku hemoglobinopatii, ponieważ uważano, że jest to rodzaj dyskryminacji. Szczególne znaczenie majš osišgnięcia genetyki dla rozwoju medycyny sšdowej. Ze względu na ogromne postępy w badaniach nad różnorodńoœcia gatuńku ludzkiego możliwe sš znacznie bardziej efektywne badania nad identyfikacjš osób, a także badania majšce na celu wykluczenie rodzicielstwa. Obecnie coraz więcej jest podstaw do tego, by nie tylko wykluczać rodzicielstwo, lecz również z coraz większš ufnoœciš rozpoznawać pozytywnie ojcostwo lub macierzyństwo. POST#PY GENETYKI A LECZENIE Postępy genetyki sš istotne również dla rozwoju terapii w medycynie. Sš one szczególnie ważne przy postępowaniu leczniczym typu przetaczania krwi lub przeszczepiania narzšdów. Niekiedy znajomoœć konstytucji genetycznej może mieć wpływ na wybór postępowania leaniczego. 162 W ostatnich latach jesteœmy œwiadkami znacznych postępów w dziedzinie# leczenia chorób uwarunkowanyeh genetycznie. Jednš z pierwszych prób leczenia chorób, w których czynniki genetyczne odgrywajš istotnš rolę, było. zastosowanie insuliny do leaenia cukr Lycy. Obecnie rozporzšdzamy wieloma# metodami zapobiegania chorobom genetycznym i ich terapii. Jednym z typów postępowania może być unikanie okreœlonych czynników œrodowiska zewnętrznego. Tak więc możemy ograniczyć dowóz substratu; który wskutek defektu enzymatycznego gromadziłby się w organizmie. Przykładami takiego postępowania jest dieta skšpofenyloalaninowa w fenyloketo= nurii, dieta bez leucyny, izoleucyny i waliny w chorobie syropu klonowego, dieta bez galaktozy w galaktozemii, unikanie pokarmów bogatych w miedŸ w chorobie Wilsona. W nietolerancji fruktozy wywołanej defektem wštrobowej aldolazy fruktozo-1-fosforanowej unika się pokarmów zawierajšcych fru= ktozę. W niektórych chorobach ważne może być ograniczenie stosowania niektórych leków. Taktyka ta jest szczególnie ważna w porfirii oraz w defekcie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej. Niekiedy postępowanie zapobiegawcze polega na unikaniu niektórych bodŸców fizycznych, tak np. w xeroderma pignzentosu#n. należy chronić organizm przed nasłonecznieniem. Innym typem podejœcia zapobiegawczo-leczniczego w chorobach genetycznych jest uzupełnienie produktu końcowego defektywnej reakcji enzymatycznej. Takš rolę odgrywa tyroksyna stosowana w niedoczynnoœci tarczyey lub hormony steroidowe w zespole nadnerczowo-płciowym. Jeszcze innym typem postępowania jest uzupełnianie brakujšcego enzymu. Stosowano tę metodę w próbach leczenia niektórych mukopolisacharydoz prze= taczaniem krwi lub krwinek. Niekiedy duże znaczenie terapeutyczne ma uzupełnienie witamin spełniajš= cych funkcję koenzymu niezbędnego do aktywacji enzymu lub zapewnienia jego większej trwałoœci. Tego typu postępowanie stosuje się między innymi w drgawkach pirydoksynozależnych, niektórych postaciach choroby syropu klonowego, acydurii metylomalanowej itd. Niekiedy dšży się do substytucji defektywnego en#ymu przez przeszczepianie narzšdów. Tak więc znamy próby przeszeepienia wštroby w zwyrodnie= niu wštrobowo- soczewkowym, nerek w chorobie Fabry'ego, szpiku w niektó= rych mukopolisacharydozach. Nieco inny ro„zaj podejœcia polega na dšżeniu do indukcji defektywnegoenzymu. Przykładem takiej strategii jest stosowańie fenobarbitalu w leczeniu niektórych żółtaczek (dšżnoœć do indukcji transferazy bilirubinowej); a także kortykosteroidów w leczeniu glikogenozy typu III. Innym typem podejœcia terapeutycznego jest dšżnoœć do hamowania działania enzymu, którego nadmierna czynnoœć prowadzi do gromadzenia się szkodliwych metabolitów. Tak np. w zespole Lescha i Nyhana zwiększona jest zawartoœć kwasu moczowego we krwi. Jest to wtórny efekt bloku metabolicznego niedoboru odpornoœciowego, zespół Lescha i Nyhana, ewentualnie hemofilia. cia tego wtórnego defektu stasowano allapurynol, œrodek hamujšcy działani# oksydazy ksantynowej. Następnym typem podejœeia terapeutycznego jest eliminacja spichrzone# substancji z organizmu. Niekiedy próbowano to osišgnšć w sposób mechaniczny, np. upustami krwi w hemochromatozie, najrzęœciej jednak stosuje siP w tym celu leki. Przykładem tego może być stosowanie penicylaminy do usuwania miedzi z organizmu w chorobie Wilsona. W ostatnich latach jesteœmy œwiadkami prób stosowania inżynierii genetycznej do zapobiegania i terapii. Polegajš one na wykorzystaniu technik re 163 #ombinacji DNA do wprowadzania do organizmu brakujšcych genów. Pierwsze próby tego rodzaju podjęto w latach szeœćdziesištych, kiedy pacjez-ztom z hiperarginemiš (niedobór arginazy) podawano wirus brodawczaka Shape'a, zawierajšcy brakujšcy ezzzym, nie uzyskano jednak przekonywajšcych efektów klinic?nych. Obecnie podejmuje się różne próby wykorzystania nowoczesnych technik do leczenia chorób genetycznych, szczególnie talassemii. Sš to próby korekty mutacji punktowych, próby aktywizacji genu gammag:obiny dla podjęcia zastępczej produkcji HbF w talassemii á-0. Próby przeszczepiania genów podejmuje się w różny sposób. Jedno podejœcie polega na wprowadzaniu cDNA połšc#onego z innym promotorem. Jest ono jednak obarczone ryzykiem braku właœciwej regulacji produkcji genów. Inne podejœeie polega na przeszczepianiu zarówno genu strukturalnego, jak i sekwencji niezbędnych do regulacji działania genu. Kolejny sposób polega na dšżeniu do wprowadzania genu zastępczego w miejsce zmutowanego genu do chromosomu, w którym normalnie ten gen jest zlokalizowany. Ten sposób, #czywiœcie, nastręcza największe trudnoœci. Próby przeszczepiania genów odbywajš się przez polšczenie genu z wektorem w postaci retrowirusa lub plazmidu i następnie wprowadzanie przeœzczepu do szpiku kostnego. Interesujšce wyniki w tym zakreœie uzyskano u myszy. Pełniejsze wprowadzenie terapii genowej u człowieka jest przedmiotem intensywnych badań. Podejœcia tego typu wymagajš dużej ostrożnoœci ze względu na to, że wprowadzenie sekwencji DNA do genomu nie jest wolne od ryzyka karcynogenezy. Dlatego też rzeczš niezwykle ważnš jest dobór takich wektorów, które nie zawierajš onkogenów. Uważa się, że najbliższymi kandydatami do prowadzenia terapii genowej sš takie choroby, jak defekt dezaminazy adenozynowej prowadzšcy do ciężkiego niedoboru odpornoœciowego, zespół Lescha i Nyhana, ewentualnie hemofilia. Ogromne znaczenie ma już dzisiaj zastosowanie inżynier genetycznej do produkowanin leków i szczepionek. W szczególnoœci stosuje się tę technikę do otrzymywania insuliny, hormonu wzrostu, somatostatyny, szczepionki prze#ciwko zapaleniu wštroby typu B itd. Uzyskane w ten sposób leki można stosować z mniejszym ryzykiem wywołania reakcji alergicznych, ponadto ten sposób przygotowywania leków usuwa ryzyko zakażenia wirusem powolnym, znane bowiem były przypadki, kiedy u pacjentów leczonych hormonem wzrostu uzyskiwanym z przysadek pobieranych ze zwłok rozwijala się choroba Creutzfelda i Jaooba. Wprowadzenie techniki inżynierii genetycznej usuwa ńiebezpieczeństwo tego rodzaju. PODSUMOWANIE W powstawaniu.zaburzeń chorobowych odgrywajš rolę czynniki genetyczne i œrodowiskowe. Udział tych czynników bywa rozmaity w różnych typach chorób. Ważna jest jednak zarówno analiza roli œrodowiska w chorobach dziedzicznych, jak i roli czynników genetycznych w chorobach zewnštrzpochodnych. Postępy biologii molekularnej stworzyly podstawę do współczesnego pojmowania chorób molekularnych. Szczególne znaczenie ma poznanie hemoglobinopat jako modelowej choroby molekularnej. Poznanie defektów enzymatycznych i ich skutków zezwala na znaczne wzbogacenie naszej wiedzy o patologii człowieka oraz wprowadzenie nie l E4 #dostępnych dotšd metod zapobiegania i leczenia. Postępy genetyki przyczyniaj# się do rozwoju współczesnej klasyfikacji chorób, w szczególnoœci do poznania niejednol-odnoœci genetycznej jednostek chorobowych. Osišgnięcia #enetyki majš znaczenie dla diagnostyki w medycynie, zwłaszcza dla diagnostyki heterozygotycznoœci, oraz pozwalajš na prowadzenie testów przesie###owych ważny-ch dla postępowania zapobiegawczego. Osišgnięcia te po2walajš również na wprowadzenie różnorodnych strategii zapobiegawczo-lc#czniczych, zaró#vno przez vrplywanie na okreœlone czynniki œrodowiska ze##vn#trżnego, ja# i sub;tytucję defektywnych produktów reakcji lub braku,jac5#cii enzvni-.#-. X rodowodów . Analiza Et.ua Ma'nikowska-Czerska Analiza występowania cech u poszczególnyeh osób i w kolejnych pokoleniach należšcych do tej samej rodziny jeœt klasycznš metodš badań genetycznych. Analiza pojedynczego rodowodu daje bardzo ograniczonš możliwoœć wnioskowania. Analiza wielu rodzin, w których występuje ta sama cecha, pozwala na okreœlenie trybu jej dziedziczenia. Opracowano w tym celu metody matematyczne. Przez wiele lat był to podstawowy sposób przekazywania cech dziedzicznych u ludzi. Wspólżyto ajezęœciej spotykanyeh w Polsce nazwisk i imion. W - dane z wywiadu, D - dane potwierdzone dokumentacjš, B - dane potwierdzone badaniem na terenie własnym KOF - karta opisu fenotyp b w T okum t i t owodla N - fenotyp prawidłowy (nie ma objawów chor ykowiscydozy, #-- heterozychoroby, O - brak danych, ++ heń typ ltyp dziki), ? - dane wštpliwe goEa, homozygota, prawidłowy Rodowód nr 842 Rozpoznanie: mukowiscydoza Zebrał: Dr E. Manikowska-Czerska. Data: 07.06.1982. Aktualizowany: Pozycja Nazwisko,imię,data urodzenia I,I Kowalski Jan 1893 I,2 Kowalska z d.Zielińska Janina 03.08.1899 11,1 Kowalski Jan 1925 II,2 Wiœniewska Janina 1926 II,3 Kowalski Stanisław II,4 Kowalski Andrzej 03.02.1930 II,5 Kowalska z d.Brzezińska Maria 08.12.1931 II,6 Majewska Maria 07.03.1932 11,7 Majewski Jan 09.10.1931 III,1 Kowal z d.Wiœniewska Maria 1946 III,2 Wiœniewska Janina 1948 II1,3 Kowalezyk Anna z d.Wiœniewska 1950 I11.4 Kowalski Jan 1952 III; J Kowalski Andrzej 1954 III,6 Majewska z d.Kowalska Maria 15.12.1957 III,7 Majewski Henryk 04.01.1956 III,8 Majewska Janina 09.07.1960(pac- jentka) IV,Z-4 zdrowe dzieci III,1 brak bliższych danych IV,5-7 zdrowe dzieei III,3 brak bliższych danych IV,8 poronienie 16Hbd 1976 IV,9 Majewski Jan 03.08.1978 IV,10 Majewska Maria 09.10.1980 lnrobandl Fenotyp # Genotyp N-W, zginšł 1939 - - l?) N-g, analiza aktywa- -f- - B cyjna paznokci N-W (?) od 1939 za granicš, brak danych N-W N-W, (bezdzietny, żonaty) N-W N-W, rodawód nieobcišżony (W) N-W N-W, rodoaród nieabćišżony (W) N-W, ma czworo zdrowych dzieci N-W, panna (bezdzietna) N-W, ma troje zdrowych dzieci N-W, kawaler, bezdzietny N-W, kawaler, bezdzietny N-W N-B N-B analiza aktywacyjna paznokei -fŃ-W N-W nie wnosi danych N-g, analiza aktywacyjna paznokci -#ł-g, potwierdzon laboratoryjnie KOF -I- - W -f- - w -I- - W 169 z jednym genem zmutowanym i jednym prawidłowym (typ dziki) można traktować jako nosićiela cechy (choroby). Wreszeie homozygotę z dwoma ge- nami prawidłowymi można traktować jako osobę zdrowš, nie wykazujšcš ry- zyka genetyeznego. Odnoœnie do wielu chorób wiadomo, że jest to uproszcze= nie i przekazywanie ich można rozpatrywać jako dziedziczenie kodominu- jšce (patrz rozdziały I, VII i XIV). W tabeli 36 podan4 przykład karty opisu rodowodu obcišżonego mu#owiscydozš. 1Va karcie podano fikcyjne nazwiska i imiona, posługujšc się częstymi w Polsce ich przykładami. Karta opisu jest dogodnym i sprawdzonym w praktyce wżorem. Na karcie jedna osoba została wpisana pomyłkowo w niewłaœciwej pozycjx. Pomyłka została poprawiona tak, żeby skreœlony tekst pozostał czytelny; miejsce to na rycinie zaznaczono gwiazdkš. Na podstawie karty narysowano drzewo genealogiczne przedstawione na ry„nie B2. Oba dokumenty powstawały stopniowo na podstawie analizy uzyskiwanych danych. Tok opracowania i rozumowania przedstawiono poniżej. Do poradni genetycznej zgłosiła się kobieta lat 20, o prawidłowym fenotypie, której przypisano fikcyjne nazwisko Janina Majewska (II1.8. pacjentka ryc. 82). Jest niezamężna, ale jest zaniepokojona przyszłoœciš, bo brat (Henryk III.7.) ma dziecko chore od urodzenia. Z wywiadu wynika, że brat ożenił się z siostrš ciotecznš (małżeństwo spokrewnione II1.6 i III.7). Z uwagi na stopień pokrewieństwa istnieje prawdapodobieństwo 1 :8 (12,5o##), że w dowolnym locus u obu tych osób występuje wspólny gen odziedziczony po jednym z dziadków (I.1 i 1.2). Istnieje więc ryzyko 1 :16 (6,25) wystšpienia 170 Ryc. 82. Przykład formularza do rysowania rodowodu. Wyrysowano fikcyjny ro- dowód na podstawie kart apisu w tabeli 36. ńie ujawnionej dotychczas w rodzinie choroby recesywnej. Ryzyko mieœci się w granicach œredniego (patrz rozdział I - Poradnictwo genetyczne), jest znacznie większe od ryzyka populacyjnego. Przy następnej wizycie pacjentka zgłosiła się z całš rodzinš brata. Z dokumentacji wynikało, że Maria Majewska (IV.10), proband, dziecko brata, jest chora na mukowiscydozę, rozpoznanš w innej placówce. Na życzenie rodziny wykonano badania i sporzšdzono kartę opisu fenotypu. W zasadzie miarodajna dokumentacja stanowi wystarczajšcš podstawę. U starszego brata probanda (Jan Majewski, IV.9) i u pacjentki I11.8 wykonano test w kierunku nosicielstwa mukowiscydozy - analizę aktywacyjnš paznokci. Nie jest to test w pełni miaroKiajny, gdyż niekiedy daje wyniki fałszywie ujemne. Załóżmy, że te wyniki były dodatnie. Rodziców probanda nie trzeba badać, gdyż sš obligatoryjnymi heterozygotami. Gen mukowiscydozy został albo przekazany przez II.4, II.5, II.6, 11.7, albo powstał na skutek œwieżej mutacji. Prawdopodobieństwo œwieżej mutacji, a zwłaszcza dwóch, jest znikome. Częstoœć genu mukowiscydozy w populacji polskiej wynoœi ok. 2o/o. Jeżeli I.1 lub I.2 byli heterozygotami, to prawd#podobieństwo, że II.4 i II.6 sš heterozygotami wynosi 25o/o. W celu weryfikacji tej ostatniej hipotezy można by zbadać osoby I.2 (I.1 nie żyje), II.4 i II.6. Zbadanie i dodatni wynik testu na nosicielstwo u jedńej z tych osób czyni hipotezę prawdopodobnš na d#statecznym paziomie ufnoœ„. Wybrano zbadanie prababki ;probanda Janiny Kowalskiej (I.2) i uzyskano wynik dodatni. Z danych tych można wycišgnšć wiele wniosków. Probanda IV.10 można na pewno okreœlić jako homozygotę pod względem mukowiscydozy. Gen tej choroby został przekazany z rodziny Zielińskich. Prawdopodobieństwo, że zmarły Jan Kowalski (I.1) był heterozygotš jest małe. Wiemy, że I.2 jest heterozygotš. Prawdopodobieństwo, że małżeństwo #wóch heterozygot ma pięcioro fenotypowo zdrowyeh dzieci wynosi 4 to jest 0,24. Stšd prawdopodobieństwo, że I.1 nie jest heterozygotš, wynosi 0,76. Można przyjšć, że gen mukowiscydozy został przekazany z rodziny Zielińskich. Można uważać, że udowodniono z wystarczajšcym prawdopodobieństwem, że II.4 i II.6 sš heterozygotami na padstawie rodowodu. Prawdopodobieństwo, że gen mukowiscydozy pochodzi od II.5 lub I1.7 jest równe częœtoœci genu mukowiscydozy w populacji, to jest około 2o/o, a œciœlej 1 : 47. Toteż narysowano drzewo genealogiczne, jak to przedstawiono na rycinie 83. Co do pozostałych nie badanych członków rodziny nie ma wystarczajšcych podstaw do próby wnioskowania o genotypie. Jest to typowa analiza rodowodu a posteriori. Drzewo genealogiczne jest typowym przykładem przekazywania względnie rzadkiej cechy recesywnej, która ujawniła się dzięki małrieństwu między krewnymi. Gdyby nie było testu, można by przyjšć z 6o/o prawdopodobieństwem, że spokrewnienie stanowi element wystšpienia choroby u IV.9. Wiadomo byłoby, że IV.10 jest homozygotš, a III.6 i III.7 sš obligatoryjnymi heterozygotami. Z tych danych można obliczyć prawdopodobieństwa genotypu IV.9 i II1.8. Co do obu wiadomo, że nie sš homozygotami typu zmutowanego, mogš więc tylko być homozygotš typu dzikiego lub heterozygotš. Z rozkładu dwumianowego można wyliczyć, że IV.9 ma 2 szanse na 3 (tj. około 66o/o), że jest heterozygotš i 1 na 3 (tj. około 33o/o), że jest homozygotš typu dzikiego. Na temat II1.8 wia„omo, że przynajmniej jedno z jej rodziców jest heterózygotš, bo brat jest obligatoryjnym heterozygotš. Prawdopodobieństwo, że jej rodzice sš obydwoje heterozygotami jest małe. Częstoœć genu Ryc. 83. Typowy rodowód rodziny, w której u dwojga dzieci wvstšpiła choroba recesywna. Negatywne dane dotyczšce innych członków rodziny, wystšpienie objawów u dwojga rodzeństwa różnej płci nasuwajš podejrzenie ehoroby o typie dziedzicznym autosomalnym recesywnym. mukowiscydozy w populacji polskiej wynosi ok. 2a/o, stšd częstoœć heterozygot odpowiada okoł# 4o,'# i przy swobodnym kojarzeniu można przewidywać częstoœć małżeństw między heterozygotami na około 0,1óoj„. Stšd III.8 prawdopodobnie jest córkš heterozygoty i homozygoty typu dzikieg#. Można więc przyjšć, że ma równe szanse, po 50o/#, że jest heterozygotš lub homozygotš typu dzikiego. Zastosowanie testu na nosicielstwo choroby wykazuje, że cecha ta jest w omawianej rodzinże przekazywana "pionowo" przez cztery pokolenia. Jest to charakterystyczne dla wszystkieh chorób metabolicznych, dla których dostępne sš testy na wykrycie heterozygot. Dla wielu cech recesywnych nie ma jednak testów na wykrycie heterozygot. Można identyfikować tylko homozygoty - osoby z danš ceehš (chorych) oraz ich rodziców - obligatoryjne heterozygoty. Powstaje wówezas typowy zapis rodowodu z "poziomym" występowaniem cech, jak to przedstawia rycxna 83. Bardzo często zdarza się, że jedna osoba w rodzińie dotknięta jest choro= bš, o której z piœmiennictwa wiadomo, że może być sprawš recesywnš lub dominujšcš autosomalnš, lub sprzężonš z chromosomem X. Rodowód może być całkowicie nieobcišżony. Ustalenie toku dziedziczenia choroby jeœt ni#możliwe i dopiero urodzenie drugiej osoby z tš samš chorobš może wyjaœnić sprawę. Najogólniej można powiedzieć, że dziedziczenie recesywne autosomalne należy podejrzewać wówezas, gdy: 1) choroba występuje u rodzeństwa; rodzice, dzieci osób ch#rych i inni krewni nie wykazujš objawów ehoroby, 2) jedna czwarta rodzeństw probanda jest dotknięta chorobš, na ogół pojedyneze rodowody nie dostarezajš #ostatecznej liczby danych, . 3) osoby pł„ żeńskiej i płci męskiej sš równie często dotknięte chorobš, 4) rodzice chorej osoby sš spokrewnieni, 5) dla celów praktycznych, jeœli udało się wyłšczyć dziedziczenie sprzężone z chromosomem X i chor#ba o znanym z literatury, recesywnym toku dziedziczenia występuje u dwojga dzieci tych samych rodziców przy nieobcišżonym rodow#dzie, można podejrzewać chorobę autosomalnš recesywnš. To samo odnosi się do rzadkiego nie zidentyfikowanego zespołu. 172 DZIEDZICZENIE CECH AUłOSOMALNYCH DOMINUJt#CYCH Dziedziczenie cech autosomalnych dominujšcych charakteryzuje się występowaniem osób o nieprawidłowym fenotypie "pionowo" w rodowodzie, tj. w# kilku kolejnych pokoleniach. Rycina 84 przedstawia rodowód rodziny obcišżonej nieprawidłowoœciš rozwoju kończyn - zespołem szczypców h#ma= ra. ftoůdowód przedstawia najczęstszš sytuacje, to jest przekazywanie cechy u potomstwa hetero#ygoty i prawidłowej homozygoty. Cecha jest przekazywana tylko przez osoby wykazujšce jš w fenotypie, dotyczy około połowy ich potomstwa i występuje w przybliżeniu równie często u obu płci. Istotne jest, że cecha przekazywana jest przez dotknięte kobiety i mężczyzn. Należy zwrócić uwagę, że cecha może występować w różnym nasileniu, co zaznaczono na rysunku. Nie stwierdzono cechy w rodzinie matki probanda i dlatego zanotowano słownie wynik wywiadu na rycinie. W niektórych rodowodach obserwuje œię pokolenia, w których cecha nie występuje, tzw. przeskakiwanie pokoleń. Jest to zjawisko rzadkie i wymaga analizy, może bowiem œwiadczyć o bardziej złożonym toku dziedziczenia. Jest to najczęœciej zwišzane z występowaniem choroby o niepełnej penetracji, a także ze zmiennym stopniem wyrażenia cechy. W niektórych rodzinach stwierdza się zjawisko antycypacji, to jest występowania w kolejnych pokoleniach bardziej nasilonych (wyrażonych) objawów choroby, albo też występowania ich we wczeœniejszym wieku. Nowsze badania wykazujš, że antycypacja jest artefaktem statystycznym i większoœćgenetyków uważa, że w rzeczywistoœci zjawisko to nie istnieje. Analizujšc rodowód należy liczye się z najczęstszš sytuacjš, wynikajšcš ze zwišżku heterozygoty z prawidłowš homozygotš. W przypadku zwišzk dwojga heterozygot 25a#o potomstwa ponosi ryzyko, że będżie zmutowanymi homozygotami. Odróżnienie heterozygot od homozygot wœród potomstwa może być trudne. U homozygot objawy.choroby sš bardziej wyrażone. Z zasady choroby dominujšce sš w stanie homozygotycznym letalne. Homozygoty te zazwyczaj ginš w.czeœnie i do#hodzi do wczesnego poronienia, które może: umknšć uwadze, lub do œmierci we wczesnym dzieciństwie. Stosunek hete= rozygot do homozygot prawidłowych w takich rodzinach będzie zbliżać się: do 2 :1, zamiast 1:1, jak to obserwuje się w wypadku zwišzku heterozygoty z prawidłowš homozygotš. W przypadku zwišzku homozygoty z chorobš dominujšcš z prawidłowym homozygotš wœzystkie dzieci sš dotkńięte cho 173: :robš. Sytuacja taka u ludzi zdarza œię niezwykle rzadko. Należy przyjšć, że :ok. 80o#'o przypadków chorób dominujšcych wišże œię ze œwieżš mutacjš W tej sytuacji rodowód jest #ałkowicie nieobcišżony. W podsumowaniu należy stwierdzić, że autosomalny dominujšcy tok dzie,dziczenia należy podejrzewać, jeżeli: 1) ch#roba występuje we wszystkich pokoleniach, 2) chóroba występuje z równš częstoœciš u obu płci i jest przekazywana przez oœoby obu pł#i, 3) dotknięta oœoba,przekazuje cechę połowie swojego potomstwa, 4) ezłonkowie rodziny nie majšcy fenotypowych cech choroby majš zdrowe dzieci, 5) dwie osoby z podobnymi miernymi nieprawidłowoœciami fenotypu majš dżieci z dużymi wadami (25o/o), podobne do rodzitów (50o/o) i prawidłowe (25#/o), to można podejrzewać zwišzek dwóch heterózygot majšcych ceehg dominujšcš; niewielkie odchylenia od nórmy u pozostałych krewnyth mo:gły umknšć uwadze; krewnych tych, przede wszystkim rodziców i następnie ródzeństwo, należy zbadać. :DZIEDZICZENIE CECH KODOMINUJĽCYCH I CECH PO#REDNICH Dziedziczenie cech kodominujšcych i cech poœrednich maże nasuwać dużE trudnoœci przy analizie rodówodu. W praktyce u ludzi ten typ dziedziczenis można udokumentować metódami biochernicznymi i serologicznymi. Genetycz#ne choroby metaboliczne należy obecnie rozważać w kategoriach dziedziczenia kodominujšcego (patrz rozdział I, VII). Grupy krwi M i N sš klasycznym i pierwszym œtwierdzonym u ludzi przykładem kodominacji. Fenotyp homozygoty M lub N jest odpowiednio M luk N, heterozygoty - MN. Cechy, które znajdujš poœredni wyraz w fenotypie .można uchwycić badajšc cechy il#œciowe. Przyjmuje się, że cechy dzieri zbli;żajš się do œredńiej pomiędzy ródzicami. Na przykład aktywnoœć okreœlonego enzymu u dziecka odpowiada œredńiej z aktywnoœci tego enzymu u oby:dwojga rodziców. Ze względu na złożone interakcje pomiędzy genami tegc typu proste rozumówanie jest mało przydatne w analizie pojedynczych roů #dówodów. DZIEDZICZENIE CECH SPRZ#ONYCH Z CHROMOSOMEM X Dziedziczenie cech spxzężonych z chromosomem X można łatwo rozpoznai #na padstawie typowego rodowodu. W wielu wypadkach jest trudno wyłšczyć i zróżnicować je z chorobami przekazywanymi jako cecha recesywna -Cechy zlokalizowane w :chromosomie X mogš być przekazywane jako recesywne lub dominujšee. MężczyŸni majš jeden chromosom X i dlategó okre:œla się ich jako hemizygoty. Konsekwencjš hemizygotycznoœci mężczyzn jes' to, że zarówno dominujšce, jak i recesywne cechy sprzężone z chromosomen X sš wyrażone. U kobiet tylko jeden chrómosom X jest funkcjonalny w każdej komórce drugi natomiast ulega inaktywacji. Inaktywacja chromosomu X odbywa sit w sposób przypadkowy. Toteż cechy dominujšce sš wyraż#ne w połowie komórek kobiet heterozygotycznych. W połówie komórek wyrażana jest alleliczna cecha recesywna. U kobiet homozygoty#anych dana #echa jest wyrażona oczywiœcie we wszystkich komórkach. Dlatego podstawówym kryterium okreœlenia heterozygoty#znoœci kobiety jest wykazanie różnórodnoœci populacji jej komórek pód względem badanej cechy. Można to łatwo wykaza# #174 za pomocš barwnych reakcji histochemicznych na aktywnoœć enzymów. Jeżeli dana cecha wišże się z niedobarem aktywnoœci, to połowa komórek po= zAstanie ńie zabarwiona, a połowa wykaże reakcję barwnš. W przypadku ba= dania aktywnoœci w homogeńizatath tkanek lub w płynach ustrojowych u kobiety homozygoty - typ dziki, aktywnoœć wynosi 100 w jednostkach arbitralnych, u heterozygoty 50, a u hom-ozygoty - typ zmutowany, jest Q lub bliska zera. U mężczyzn adpowiednie aktywnoœci wynoszš 100 lub 0, za= leżnie od tego, kt„ry z alleli występuje. Z zasady recesywne choroby sprzę= żone z chromosomem X sš letalne u homozygot płci żeńskiej, toteż chorobY te rzadko występujš u kobiet. Klasycznymi przykładami recesywnych chorób sprzężonych z chromoso= mem X sš hemofilia A i dystrofia mięœniowa typu Duchenne'a. W zwišzku z postępami leczenia hem#filii rnężczyŸni obcišżeni #tš ehorobš przeżywajš długi czas i majš dzieci. Rottowód rodzinny z hemofiliš przedstawia ryci= na 85 a. Wykazuje on cechy typowe. Tylko mężczyŸni majš objawy choro= by, wszyscy ich synowie sš zdrowi, a córki sš nosicielkami. Ryc. 85. Rodoworly rodzin z hemofiliš A: a - rodowód typawy dla recesywner cechy sprzężonej z chromasomem X potomstwn hemofilik,a i homozygoty, typ dziki (zdrowej); b - potomstwo hemofilńka i nosicielki heterazygoty, objawy choroby# wystšpiły u dwóch córek homozygnt - zdarzenie niezwykle rzadkie. łrzeba dodać, że objawy hemofilii mogš wystšpić u kobiet homozygot, po= chodzšcych ze zwišzku hemizygotyrznego mężczyzny i heterozygoty noœicielkż hemofilii (ryc. 85 b). Rycina 86 przedstawża rodow„d rodziny z dystrofi# mięœniowš typu Du-chenne'a. Cechš charakterysty#znš tego rodowodu jest to,. że chorzy mężczyŸni nie dożywajš wieku repradukcji. Ryc. 86. Rodowód rodziny z dystrofiš mięœniowš typu Duchenne'a, dziedziczenie# eeehy recesywnej sprzężonej z ehromosomem X. l7ł Recesywny tok dziedziczenia sprzężony z chromosomem X należy podejrzewać, jeżeli: 1) choroba występuje znacznie częœciej u mężczyzn niż u kobiet, 2) chory mężczyzna nigdy nie przekazuje cechy synom, 3) wszystkie córki chorego sš nosicielkami i choroba występuje u ok. 50o/o ich synów, 4) choroba jest ciężka i mężczyŸni ńie dożywajš wieku reprodukcyjnego, #to w kolejnych pokoleniach występujš serie kobiet nosicielek. Dziedziczenie dominujšce sprzężone z chromosomem X dotyczy niewielu #cech. Prakty#nie ważne jest (patrz niżej), że w ten sposób dżiedziczy œię #cecha grupowa krwi Xg. Również w ten sposób dziedziczy się krzywica oporna na witaminę D. Zgodnie z tym, co powiedziano wyżej, objawy choroby sš Iżejsze u heterozygot płci żeńskiej niż u hemizygot (płci męskiej). Dziedżiczenie dominujšce sprzężone z chrmmosomem X należy podejrzewać, jeżeli : 1) chory mężczyzna ma wyłšcznie chore córki i wyłšcznie zdrowych synów, 2) chore kobiety heterozygoty przekazuja cechę ok. 50o/o swego potomstwa, ńiezależnie od jego płci, chore kobiety homozygoty przekazujš cechę wszystkim swoim dżieciom, 3) choroba wyst#puje dwa razy cz꜄ej u kobiet niż u mężezyzn. Na zakończenie należy podkreœlić, że cechy sprzężone z chromosomem X nie sš przekazywane potomstwu płci męskiej przez ojców. Odstępstwo od tej reguły stanowiš aberracje chromosomów płciowych, w których dodatkowy chromosom X pochodzi ad ojca. Rycina 87 przedstawia typowy rodowód dla dziedziczenia cechy dominujšcej sprzężonej z chromosomem X. áZIEáZICZENIE NIEftEGULAftNE Dżiedziczenie nieregularne, zwišzane z przekazywaniem aberracji chromosomów i cech warunkowanych jednogenowo, nie daje typowych rodowodów. Jednakże zebranie danych modzinnych jest istatne. Liezba chůorych w rodzinie i ich pozycja w rodowodzie obcišżonym chorobš wielogenowš ma zaœadnicze znaczenie dla ustalenia ryzyka genetycznego. Około 4o/o przypadków aberracji chrom#somalnysh występuje rodzinnie i analiza rodowodu pozwala na znale#ienie nosicieli transl#kacji. Analiza ta ma również znaezenie dla oceny ryzyka empirycznego, które jest różne dla poszczególnych typów dziedzicznych aberracji chromosomalnych. 176 Ryc. 87. Przykład dziedziczenia cechy dominujšcej, sprzężonej z chromoso- mem X. FENOłYP A ANALIZA IZODOWODU Rodzaj defektu genetycznego i zwišzany z nim fenotyp choroby nie pozwala na wnioskowanie o toku dziedziczenia. Większoœć genetycznych chorób metabolicznych należy do autosomalnych recesywnych chorób jednogenowych, aczkolwiek wiele z nich jest sprzężonych z chromosomem X (np. choroba Lescha i Nyhana lub nieprawidłowoœci dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, tj. G6PD). Opisano jednak wielogenowy mechanizm odpowiedzialny za różnorodnoœć reakcji hemolitycznej u osób z niedoborem G6PD. Różnorodnoœć ta zależy od szybkoœci acetylacji sulfonów, która jest warunkowana przez geny autosomalne. Magon i wsp. (1981) wykazali, że w niektórych przypadkach choroba hemolityczna zwišzana z niedoborem G6PD wykazuje połimorfizm dzięki temu, że jest schorzeniem wielogenowym, a nie dzięki różnorodnoœci serii alleli występujšcych w locus G6PD chromosomu X. Można liczyć się z ustaleniem mechanizmów wielogenowych warunkujšcych różnorodnoœć wariantów i innych pozornie jednogenowych chorób. Trzeba też liczyć się z tym, że serie alleli prawidłowych mogš modyfikować stopień ekspresji dominujšcych chorób autosomalnych. Inaczej mówišc, zmutowany gen dominujšcy może wyrażać się w różny sposób, zależnie od tego, który z alleli z prawidłowej serii genów recesywnych występuje wspólnie z nim. U homozygot mogš występować kombinacje różnych alleli zmutowanych. Stšd ta sama w zasadzie choroba może mieć różny obraz kliniezny u członków tej samej rodziny. Rodzaj i rozległoœć zmian nie œwiadczš o niczym. Rózległe wady strukturalne (tzw. wielowadzie), mogš być wyrazem autosomalnej choroby dominujšcej lub dziedziczenia jednogenowego. Zespół Laurence'a, Moona i Biedla (hipogonadyżm, polidaktylia, otyłoœć, głuchota, niedorozwój umysłowy i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki) dziedziczy się jako recesywna choroba autosomalna. Podobnie izolowane wady budowy, jak zaroœnięcie odbytu lub zwężenie wodocišgu mózgu (Sylwiusza) i następcze wodogłowie, mogš być sprawami jednogenowymi, recesywnymi lub sprzężonymi z chromosomem X, albo dominujšcymi. Aberracje chromosomalne z zasady prowadzš do licznych wad wrodzonych. Wreszcie różne geny mogš prowadzić do tego samego defektu. "Wrodzona" głuchota jest tego przykładem. Stevenson i Cheeseman opisali rodowód przedstawiony w skróconej formie na rycinie 88. Na szczególnš uwagę zasługuje 6 zdrowych i o prawidłowym słuchu synów (IV) głuchego od urodzenia małżeństwa spokrewnionego w III pokoleniu. Ryc. 88. Rodowód rodziny obcišżonej "wrodzonš" głuchotš, wykazujšcej genetycznš heterogennoœć tej choroby (na podstawie danych Stevensona i Chee#V semana). 12 - Zarys genetyhi SPRZĘ#ENIE CECH A ANALIZA RODOWODU Dzięki współczesnym technikom badania lokalizacji cech uzyskuje się coraz to bardziej szczegółowe mapy chromosomów człowieka. Gen warunkujšcy ehorobę może być sprzężony z genem warunkujšcym cechę, którš łatwo jest oznaczyć metodami serologicznymi lub biochemicznymi. Cecha ta może służyć jako znacznik (słowo znacznik jest tłumaczeniem angielskiego "marker", z nie znanych bliżej przyczyn niektórzy autorzy używajš w języku polskim okreœlenia "cecha markerowa"). Występowanie znacznika w fenotypie pozwala zidentyfikować nosiciela choroby lub osobę obcišżonš chorobš, jeszcze zanim ujawniły się jej objawy. Cechy znacznikowe mogš być wykorzystane w diagnostyce prenatalnej, jak np. cechy antygenów zgodnoœ„ tkankowej (układu HLA) w prenatalnym rozpoznaniu zespołu nadnerczowo-płciowego. Sprzężenie cech zostało omówione w rozdziale VII o dziedziczeniu jednogenowym. W tym miejscu należy tylko podać warunki, jakim muszš odpowiadać badana cecha i cecha znacznikowa. W przypadku badania sprzężenia cech autosomalnych: 1) każda z obu cech musi być warunkowana genem występujšcym w pojedynczym locus, oba locż muszš być ze sobš œciœle sprzężone, 2) współczynnik rekombinacji obu locż powinien być okreœlony iloœciowo, 3) badana osoba musi być potomkiem podwójnej heterozygoty i (najczęœciej) podwójnej homozygoty, 4) trzeba dysponować miarodajnymi danyxni dla okreœlenia, czy cecha badana i znacznikowa sš w pozycji cżs czy trans u podwójnej heterozygoty (jedno z rodziców badanej osoby). Murphy i Chase (1975) obliczyli, że można przewidywać, że mniej niż 20o/o par rodzicielskich obcišżonych rzadkimi chorobami genetycznymi będzie spełniać te warunki. Obecnie istotnym elementem badania rodowodu jest badanie DNA za pomocš technik opisanych w rozdziale XVI. PODSUMOWANIE Zebranie, zapisanie i analiza danych rodzinnych jest ważnym elementem weryfikacji i uœciœlenia choroby genetycznej. Trzeba systematycznie zachowywać następujšcy tok postępowania: 1) zebrać dane personalne, 2) narysować drzewo genealogiczne, 3) zebrać i nanieœć na kartę rodowodu i drzewo genealogiczne dane o fenotypach poszczególnych osób w rodzinie. Dane o fenotypie uzyskane z wywiadu należy w miarę możliwoœci zweryfikować przez uzyskanie dokumentacji medycznej lub wykonanie badań. Znany z piœmiennictwa tok dziedziczenia choroby należy porównać z badanym rodowodem. Charakterystyczne rodowody otrzymuje się w przypadkach autosomalnych lub sprzężonych z chromosomem X dominujšcych i recesywnych cech. Choroby wielogenowe i wywołane aberracjami chromosomalnymi nie dajš charakterystycznych cech. W analizie niektórych rodowodów (mniej niż 20##o) można wykorzystać sprzężenie cech dla badania toku dziedziczenia i identyfikacji osób ryzyka genetycznego. XI. G enet#ka populac#j na Ignacy Wald PODSłAWOWE POJĘCIA Genetyka populacyjna zajmuje się zachowaniem genów w populacjach. Przez populację rozumiemy zbiór osobników, którzy mogš wchodzić ze sobš w stosunki seksualne i mieć potomstwo. Takie znaczenie terminu "populacja" różni się zatem od zakresu jego stosowania w statystyce. W znaczeniu genetycznym nie będzie więc populacjš grupa żołnierzy w jednostce wojskowej, może ona natomiast stanowić populację w sensie statystycznym. Genetyka populacyjna ma istotne znaczenie dla poznania struktury i funkcjonowania populacji ludzkich i stanowi jednš z podstaw teoretycznych nauki o zdrowiu publicznym. Podstawowym pojęciem genetyki populacyjnej jest częstoœć genu, która oznacza stosunek liczby alleli okreœlonego rodzaju do liczby wszystkich genów w danym miejscu genowym w populacji. Ze względu na to, że człowiek jest istotš diploidalnš, liczba genów w danym miejscu genowym w populacji jest dwa razy większa od liczby osobników w populacji. WyobraŸmy sobie np., że w populacji 1000-osobowej występujš dwie osoby z plšsawicš Huntingtona. Ponieważ jest to cecha dominujšca, do wystšpienia objawów choroby wystarczy jeden gen. Ze względu na rzadkoœć zjawiska można przypuszczać, że osoby dotknięte chorobš sš heterozygotami. Tak więc częstoœć genu plšsawicy Huntin.gtona w badanej populacji wyniesie: W przypadku cech kodominujšcych ocena częstoœci genu polega po prostu na zliczeniu odpowiednich alleli i podzieleniu ich przez podwójnš liczbę osobników w populacji. Przykład takiego oblieenia dla grup krwi M i N #odaje tabela 37. ł a b e 1 a 39. Obliczenie częstoœci genów grup krwi M i N w populacji 1000 osób Genotypy MM I MN I NN Razem Liczebnoœć osobników œ64 364 1000 Liczba alleli M 1150 Liczba alleli N 850 179 Ogólnie rzecz bioršc, jeœli mamy 2 allele kodominujšce: A i B, liczebnoœć odpowiednich genotypów oznaczamy odpowiednio przez naA, #AB, nBB, całko- witš liczbę osób w populacji oznaczymy przez N (N = naA -#- -nAB -f- -nBB), to wtedy częstoœć genu A wyniesie: Bardziej złożona jest sytuacja, kiedy jeden z alleli jest dominujšcy, a drugi recesywny. Do ustalenia częstoœci genów wykorzystuje się wtedy prawo Hardy'ego i Weinberga. PRAWO HAftDY'EGO I WEINBEftGA Jest to podstawowa zależnoœć występujšca w genetyce populacyjnej. Została ona ustalona w 1908 r. niezależnie przez matematyka angielskiego G. H. Hardy'ego i lekarza niemieckiego W. Weinberga. Hardy opracował tę zależnoœć w odpowiedzi na pytanie biologa angielskiego R. Punnetta, który interesował się, czy allele dominujšce w populacji wypierajš allele recesywne. Hardy uważał odkrytš przez siebie zależnoœć za tak banalnš, że pracy na ten temat nie posłał do czasopisma matematycznego, ale ogłosił jš w ogólnonaukowym piœmie Scien.ce. Potem okazało się, że jest to podstawowe prawo genetyki populacyj nej. Zasada ta polega na następujšcej zależnoœci: jeżeli w populacji krzyżujšcej się w sposób losowy w danym miejscu genowym, występujš 2 alłele A f a o częstoœciach odpowiednio p i q, to stosunki wzajemne liczebnoœci genotypów można wyrazić następujšcym wzorem: %taA : #LAa : %#aa = #7= : 2g7q : q= innymi słowy, w populacji spełniajšcej założenia prawa Hardy'ego i Weinberga częstoœć genotypu AA wynosi p=, Aa 2pq, an q#. Sš to składniki dobr Le znanego wzoru na kwadrat dwumianu: (p -#- q)z. Można mieć wštpliwoœci, czy w populacjach ludzkich dobór seksualny odbywa się w sposób losowy. Tak oczywiœeie nie jest. Ludzie jednak przy dobieraniu partnerów seksualnych biorš pod uwagę takie cechy, jak wzrost, urodę, inteligencję, majštek itd., żadna z tych cech na ogół nie bywa uwarunkowana genetycznie w sposób prosty. Przy doborze seksualnym partnerzy nie zwracajš na ogół uwagi na to, jakie sš grupy krwi wybranego lub wybranki, jaka jest jego lub jej wrażliwoœć na smak fenylotiomocznika itd. Innymi słowy, z punktu widzenia wielu cech uwarunkowanych genetycznie w sposób prosty dobór seksualny w populacjach ludzkich jest losowy. Ze względu na ograniczenia społeczno-kulturowe losowoœć ta z reguły nie bywa pełna. Takie ograniczenie losowoœci wynika np. z zakazów zwišzków 180 kazirodczych obowišzujšcych w prawie wszystkich kulturach. Odchylenia od losowoœci powstajšce z tej przyczyny sš jednak niewielkie i nie odgrywajš istotnej roli, jeżeli populacja jest dostatecznie duża. Jak wykazuje wiele badań, rozkład Hardy'ego i Weinberga jest wystarczajšco dobrym przybliżeniem zależnoœci między częstoœciš genów a częstoœciš genotypów w bardżo wie1u przypadkach. Regułę Hardy'ego i Weinberga można również uogólnić na większš liczbę alleli niż dwa. Prawo Hardy'ego i Weinberga pozwala na oznaczenie częstoœci genów w populacji w różnych warunkach. WyobraŸmy sobie, że interesuje nas częstoœć genów fenyloketonurii w populacji. Częstoœć tego zaburzenia (dżiedziczenie recesywne) wynosi ok. 1 na 10000 urodzeń w większoœci populacji europejskich. CzęstoœE genu fenyloketonur wynosi zatem q = 1 , tzn. 10 000 0,01. Częstoœć genu "dzikiego" wynosi odpowiednio 0,99. Na podstawie tej reguły można również ocenić częstoœć heterazygot, wynosi ona bowiem 2pq, a przy małej częstoœci genu r#cesywnego p można traktować jako bliskie jednoœci. Wtedy częœć heterozygot _cv 2 p. W przypadku fenyloketonurii częstoœć ta wynosi ok. 1 : 50, tzn. 0,02. Znajomoœć tej zależnoœci ma istotne znaczenie dla zrozumienia pochodzenia chorób recesywnych w populacji. W ogromnej większoœci przypadków osoby chore na choroby recesywne rodzš się ze zwišzku dwojga heterozygotycznych nosicieli. Z tego punktu widzenia jasne staje się, jak bezzasadne były postulaty zwolenników eugeniki negatywnej, domagajšcych się sterylizacji osób chorych na choroby uwarunkowane genetycznie w celu zapobiegania ich wystšpieniu w populacji. Tabela 38 przedstawia zależnoœć między częstoœciš homozygot a częstoœciš heterozygot przy różnych częstoœciach występowania homozygot. 'C a b e I a 38. Zw#išzek między częstoœciš homozygot i heterozygot przy różnych ezęstoœciach występowania homozygot CzęstoœE homozygot CzęstoœE Stosunek częstoœci heterozygot heterozygot do homozygot 1:10 1:2,3 4,3:1 1:100 1:5,6 18:1 1:1000 1:16 61:1 1:10000 1: 51 198:1 1:100000 1:159 630:1 1:1000000 1: 501 1998:1 Ze względu na to, że głównym Ÿródłem chorób recesywnych sš heterozygoty, w celu zapobiegania chorobie należałoby sterylizować nosicieli. Ponieważ każdy z nas jest heterozygotycznym nosicielem 5 do 6 genów odpowiedzialnych za ciężkie choroby, tego typu działanie wymagałoby steryl:zacji całej populacji. W ten sposób osišgnięto by wprawdzie zabezpieczenie przed szerzeniem się chorób, załatwiano by jednak sprawę istnienia ludzkoœci w ogóle. Jeœli nie działajš czynniki wpływajšce na odchylenia od zasady Hardy'ego i Weinberga, takie np., jak mutacja, selekcja, migracja, to częstoœć genu w następnym pokoleniu nie ulegnie zmianie i częstoœci genotypów w następnym pokoleniu będš takie same. Dlatego też prawo to niekiedy nosi nazwę równowagi Hardy'ego i Weinberga. 181 Jeżeli dochodzi do zmieszania się dwóch populaeji ů o różnych ezęstoœciach genów; to - jeœli krzyżowanie odbywa się w sposób losowy - już w na- stępnym pokoleniu częstoœć genotypów będzie zgodna z prawem Hardy'ego i Weinberga. POLIMORFIZMY GENEłYCZNE ł a b e 1 a 39. Niektóre polimorfizmy genetyczne u człowieka Antygeny krwinek Białkak owicy c e k h Ań yy k Enzymy czerwonych wštroby ABO haptoglobiny fosfataza Se se (cecha wy- (HplS,HplF, kwaœna dzielania) Hp) dehydrogena- MNSs _ transferyny za glukozo- P lPi,Pz) (łfc,łfs, -6-fosfoglu- Rh TfD) konianowa Lewis (Le,Le) grupy Gc kinaza Duffy (G#1,G#z) adenylowa (Fya,Fyb,Fy) ceruloplazmi- Peptydaza A Kidd (Jka,Jkb) na (CpA (P Diego (Die,Dib) CpB,CpC) Pep Lutheran (Lua, system Gm fosfogluko- Lub) (Gm'ůz, mutazy Kell (K,k) Gm3,s) Xg (Xga,Xg) pseudocholi- noesteraza surowicy układ HLA dehydrogenaza alkoholowa (ADH2, ADH3) Polimorfizmem g#netycznym nazywamy sytuację, w której w danym miejscu genowym występujš w populacji co najmniej dwa allele, przy czym częstoœć każdego z genotypów nie jest mniejsza niż 1 - 2o/o. Przy takiej częstoœci genetypów występowanie allela w populacji nie może być tłumaczone wyłšcznie powstawaniem nowych mutantów. Szczególnš rolę w badaniu polimorfizmów odegrało wprowadzenie różnych metod elektroforezy białek do praktyki badań populacyjnych. Jak wykazujš badania prowadzone w populacjach różnych gatunków, polimorfizm występuje w ok. 30o/a locż. Jak wykazały badania H. Harrisa i wsp. nad polimorfizmem białek, œrednio co 12 osobnik w populacji jest heterozygotš dla badanych locż. Jest to podstawš dla ogromnej zmiennoœci indywidualnej. Na podstawie badania tylko 14 białek stwierdzono, że prawdopodobieństwo, by losowo dobrani z populacji osobnicy mieli identyczny skład genetyczny wynosi . Najważniejsze polimorfizmy 35000 genetyczne u człowieka przedstawia tabela 39. Niekiedy polimorfizm może mieć istotne znaczenie biologiczne. Przykładem tego sš sytuacje, kiedy różne genotypy majš rozmaite wartoœci przystosowawcze. Pouczajšca w tym względzie jest sprawa niedokrwistoœci sierpowatokrwinkowej i malarii tropikał#ej. Jak wiadomo, homozygoty genu niedokrwistoœci sierpowatokrwinkowej HbS/HbS majš ciężkš niedokrwistoœć he 182 ł a b e 1 a 40. Częstoœć mutacji u cziowieka ' Cecha Liczba mgtantów na lOá amet Cechy dominujšce autosomalne Achondroplazja 6-13 Aniridia Dystrofia miotoniczna 8-11 Siatkówezak zarodkowy 6-12 Akrocefalosyndaktylia Stwardnienie guzow ate 5-15 Neurofibromatoza 44-1Ofl łorbielowatoœE nerek 65-- 120 Cechy reeesy#rne autosomalne Mikrocefalia 25- 49 Rybia łuska wrodzona 11 Cereidolipofuscynoza - postać mlodzieńeza 5lepota na barwy całkowita ienylohe!on##ria 25 Cechy sprzężone z e!tro#=iosotnem X Hemofilia A 32- 57 Hemofilia B 2- 3 Dystrofia.rnie#niowa Duchenne'ti 46-105 Zespół Bloeha i Sulzbergera 6- 20 Mutacje chrorz:osomowe zdarzajš się znacznie częœciej niż mutacje genowe. Przykładem może być trisomia 21 występujšca z częstoœciš 1 na 700 urodzeń, w ok. 99##o przypadków powstaje ona de #ovo. Mutacje mogš zależeć od wielu czynników. Jak wisdomo, ryzyko mutacji chromosomowej, zwłaszeza pQwstajšcej w wyniku ńierozłšczenia, roœnie wraz z wiekiem matki, ryzyko niektórych mutacji genowych roœnie z wiekiem ojca. łnnym czynnikiem tnogšcym prowadzić do odc:hylenia od równowagi Hardy'ego i Weinberga jest migracja. Wpływy migracji mogš być rozmaite. Tak np., jeże?i migrujš z populacji osoby cechujšce się naj?epszym zdrowiem, to w pop#:lacji, w której występuje częsta choroba genetyczna, ##vłaszeza dominujšca, może dojœć do wzrastu ezęstoœ„ tego genu. Z drugiej strony procesy migracyjne prowadz.# do rozpa#u grup izolowanych i do zmniejszenia wplywu spokrewnienia na częstoœć występowania cechy, a także do zmniejszenia odchylajšcego dzialania dryfu na częstoœć genóvr. Kolejnym czynnikiem wpływajšcym na odehylenie od równowagi genetycznej jest selekeja. Działa ona wtedy, kiedy różne genotypy majš rozmaite przystosowanie biologiczne mierzone liczbš posiadanego potomstwa. #'Vspółczynnik selekeji jest dopełnieniem do jednoœci współezynnika przystosowania biologicznego (s = 1 - f). Proces selekeji działa odmiennie w zależnoœci od tego, #y chodzi o cechy dominujšce, czy recesywne; selekeja działa znacznie wolniej na częstoœć genów cech recesywnych (ryc. 89). Należy zaznaczyć, że selekeja m#że działać w każdej fazie cyklu życiowego organiżmu. Może zatem od#ziaływać na twoz~zenie gamet, na ich przeżycie. na tworzenie się zygoty, rozwój płodu, przeży„e noworodków, rozwój w okresie postnatalnym i ##łreszcie na okolicznoœci zwišzane z prokreacjš. Okolicznoœci zewnętrzne mogš wpływać na działanie selekeji w różnych stadiach jej rozwoju. Tals np. przed wprowadzeniem insuliny osoby chore na cukrzycę młodzieńezš podlegały ostrej selekeji. Odpornoœć na choroby zakaŸne była 184 Ryc. 89. Wpływ selekeji na czgstoœć cechy dominujšcej (linia \ cišgła) i recesywnej (linia przerywana). Wspbłezynnik selekeji wynosi 100%. Cecha dominujšca ó 0,8 ## zostaje wyeliminowana po pierwszym pokoleniu, częstoœE cechy recesywnej zmniejsza się powołi. # 0;6 \\ -u \  0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 1 8 9 t0 Pokolenia ważnym czynnikiem selekcyjnym, zwłaszeza przed wprowadżeniem antybiotyków. Powyżej była mowa o przypadkach, w których homozygoty i heterozygoty majš różnokierunkowe wartoœci przystosowaweze. W sytuacji, w której homozygota jest dotknięta ciężkš chorobš, a heterozygota ma z różnyeh przyczyn podwyższony wskaŸnik przystosowania biologicznego, selekeja może dżialać w kierunku utrzymania częstoœci genów w populacji, mimo że cecha wywołana przez ten gen jest szkodliwa. Mogš się zdarzać i odmienne sytuacje, takie np., w których selekeja działa nie przeciw homozygotom, ale przeciw heterozygotom. Przyk#adem tego jest grupa krwi Rh. Heterozygoty obcišżone sš ryzykiem konfliktu serologicznego. W tej sytuacji ciœnienie selekcyjne dšży do zmniejszenia częstoœci heterozygot w populacji. W populacjach niewielkich występujš fluktuacje losowe w częstoœci poszezególnych genów. Zjawisko to nosi nazwę dryfu genetycznego. Może ono prowadzić do istotnych odehyleń od pierwotnej częstoœci genów. Przykładem działania dryfu jest niezwykle duża częstoœć achromatopsji (autosomalnej recesywnej zupełnej œlepoty na barwy) na wyspie Pingelap na Oceanie Spokojnym. W końcu XVIII wieku na wyspie tej w wyniku huraganu wyginęła prawie cała ludnoœć; pozostało ok. 30 mieszkańców. Przypuszeza się, że ówezesny wódz ludnoœci wyspy był heterozygotš pod względem achromatopsji. Miał on kilka żon i wiele dzieci. Jeœli przyjšć tę hipotezę, wskutek dryfu częstoœć genu wzrosła z pierwotnej wartoœci 1,4o/o do 23o#o w połowie XX wieku. Istotnš rolę w procesach dryfu odgrywa zjawisko zwane efektem założyciela, ponieważ wystšpienie genu u jednego z członków populacji wyjœciowej może losowo doprowadzić do znaeznej częstoœci genu w następnych pokoleniach. Przypuszeza się, że ze zjawiskiem dryfu wišże się duża częstoœć niektórych genów w populacjach izolowanych, nie zawsze geograficznie, ale niekiedy kulturowo. Tak np. częstoœć choroby Taya i Sachsa i niektórych innych lipidoz jest wielokrotnie większa u Żydów aszkenazyjskich, którzy mieszkali w Europie Œrodkowej i Wsehodniej niż u reszty ludnoœci tych krajd# czy Żydów innego pochodzenia. Przypuszeza się, że ta niezwykle duża częstoœć genu (i choroby) wywo#ana jest fluktuacjš przypadkowš, ehoć nie można wyklu 185 czyć, że heterozygoty tych ciężkich chorób miały jakieœ przewagi biologiczne, mogły być np. bardziej odporne na gruŸlicę, częstš w skupiskach gett. W mia- rę rozpadu grup izolowanych i wzrostu liczebnoœci populacji zjawiska dryfu za- nikajš. SPOKHEWNIENIE W POPULACJI Jednym z czynników zaburzajšcych równowagę Hardy'ego i Weinberga jest spokrewnienie w populacji. Wzrost częstoœci małżeństw między krewnymi nie wpływa sam przez się na częstoœć genów, wpływa jednakże na częstoœć genotypów, zwiększa mianowicie częstoœć homozygot w populacji. Miarš spokrewnienia jest współczynnik wsobnoœci. Jest to prawdopodobieństwo, że w da #_ 1 _ F 66 F 2Œ6 4 Ryc. 90. Rodowody przedstawiajšce niektóre przykłady zwišzków krewniaczych. Wartoœć F odnosi się do potomstwa ze zwišzku zaznaczonego liniš podwójnš; A - kuzynowie z pierwszej linii, B - kuzynowie z drugiej linii, C - kuzynowie z trzeciej linii, D - podwójni kuzynowie z pierwszej linii, E - brat i siostra. nym miejscu genowym wystšpi homozygotycznoœć wywołana tym, że oba geny pochodzš od wspólnego przodka. Współczynnik wsobnoœci oznacza się na ogół przez F. Współczynnik wsobnoœci u dziecka zrodzonego ze zwišzku między 1 wujkiem a siostrzenicš wynosi -, u dziecka kuzynów z pierwszej linii 1 1 -, u dziecka kuzynów z drugiej linii - (ryc. 90). 16 64 W warunkach częstego występowania małżeństw spokrewnionych przeciętne F w populacji będzie większe od zera. Częstoœć genotypów AA wynosi wtedy pz --# Fpq, częstoœć genotypów aa: q2 -f- Fpq, częstoœć heterozygot natomiast: 2pq - 2 Fpq. W niektórych populacjach częstoœć małżeństw spokrewnionych, a zwłaszcza z kuzynami pierwszej linii, była doœć duża. Rzutowało to również na częstoœć 186 występowania chorób recesywnych. W miarę przemian kulturowych i spadku przeciętnego współeżynnika spokrewnienia zmniejsza się również częstoœć chorób recesywnych. Największy stopień spokrewnienia występuje u człowieka w przypadkach kazirodztwa. U dzieci zrodzonych ze zwišzków kazirodezych jest wyraŸnie zwiększona częstoœć chorób recesywnych, a jak sšdzš niektórzy, również i niektórych zaburzeń uwarunkowanych wieloczynnikowo. GENEłYKA POPULACYJNA I EWOLUCJA Zasadniczš rolę w procesie ewolucji odgrywa współdziałanie między mutacjami a selekejš. Dokładniejsze wejrzenie w proces ewolucji stało się możliwe dzięki rozwojowi metod biologii molekularnej. Zastosowanie ich pozwoliło na analizę rozwoju ewolucyjnego różnych białek o istotnym znaczeniu biologicznym. Szezególnie ważne badania dotyczyły takich białek, jak cytochrom C i hemoglobina. Rycina 91 przedstawia ewolucję cytoehromu C i wskazuje liczbę substytucji aminokwasowych w rozwoju od grzybów do cżłowieka. Jednym z mechanizmów majšcych znaczenie w ewolucji sš duplikacje występujšce w poszezególnych genach. Duplikacje te sprzyjajš powstawaniu niesymetrycznych przekrzyżowań (crossing over). Badania nad niektórymi białkami wykazujš, że odgrywajš one rolę również u człowieka. Przykładem tego jeœt haptoglobina człowieka. Rycina 92 pokazuje rolę tych procesów w powstawaniu różnych wariantów haptoglobiny. Badania nad ewoluejš molekularnš doprow„dziły do pewnych nowych koncepeji dotyczšcych mechanizmów e#volucji. Według tradycyjnych poglšdów ewolucjonistycznych ogromna więkœzoœć mutacji jest szkodliwa i jest szybko eliminowana działaniem selekeji. Rz„dko zdarza się mutacja korzystna dla gatunku, która może być lub.może nie być podtrzymywana przez selekeję. Badania nad substytucjami aminokwasówymi zrodziły przypuszezenia, że w ewolucji molekularnej odgrywajš również rolę mutacje neutralne, mutacje, których wartoœć przystosowaweza jest bliska zeru. Utrwalenie t„kich nowych mutacji jest wynikiem dryfu genetycznego. W œwietle tych koncepeji procesy losowe odgrywałyby znacznie większš rolę, niż dotšd przypuszezano. Spór pomżędzy selekejonistami a neutralistami nie jest dotšd rozstrzygnięty, wydaje się, że w ewolucji mogš mieć znaczenie oba wspomniane mechanizmy. W dyskusjach nad rozwojem współezesnej cywilizacji nierzadko spotyka się stwierdzenia, że postęp medycyny doprowadzi do eliminacji doboru naturalnego. Twierdzenia te nie sš całkowicie uzasadnione. Po pierwsze, selekeja działa w różnych fazach życia organizmu i selekeja realizujšca się w okresie prenatalnym niewiele zmienia się pod wpływem postępów medycyny. Istniejš dowody na to, że selekeja w stosunku do niektórych cech uległa osłabieniu. Dotyczy to np. cukrzycy, krótkowzrocznoœci itd. Należy pamiętać jednak o tym, że rozwój medycyny, opróez rozluŸnienia niektórych rodzajów selekeji, może prowadzić do zaostrzenia selekeji wywieranej na niektóre geny szkodliwe. Przykładem tego jest omawiany powyżej polimorfizm zrównoważony dotyczšcy niedokrwistoœci sierpowatokrwinkowej i malarii tropikalnej. Postęp medycyny, eliminacja pełzaka malarii prowadzi do zmniejszenia częstoœci genu hemoglobinopatii S. Tak więc wpływ rozwoju medycyny na rozmaite częstoœci genowe nie jest bynajmniej jednokierunkowy. Postęp medycyny może mieć zarówno wpływ dysgeniczny, jak i eugeniczny. 187 40 ,2 # 35  # # -1l Y # O L #c 30 # 20 13 g 4 # 75 11 1S #O 15 515 9 8 6 11 1 4 1 N r # d - O #  š # # U # # o L o E tl Ó L Y aob # b # d c " # #„ ć.ó #,ó c # d #.n #< # œ Q, ó,c a n # 'a c u u # # c `# - c # # r# # u d Q' c a, # -c #' # # b 0 # a# > d # o # o > C ##~ůN-N-NVYY 0.Y#Yá.#UlOYŻ U ů #.Rezkrę- Grzyb# # # #vce Strunowce Hyc.: 91. Ewolucja cytochromu C. Na ltażdym odcinku zaznaczono lfczbę podsta#vień aminokwasowych, które zaszły w czasie odpowiednich zmian ewolucyjnych (modyfikaeja wg Margoliasha). Należy zwrócić również uwagę na to, że ńiektóre procesy #ysgeniczne zwišzane z postępem medycyny sš niezwykle powolne. Można założyć np., że stosowane obecnie postępowanie zapobiegawcze dotyczšce fenyloketonurii likwiduje zmniejszenie przystosowania biologicżnego, występujšce w tej chorobie. Dotšd na ogół ludzie chorzy na fenyloketonurię najczęœciej nie mieli po188 HplF HplF HP2 Mutacja HplS HplS a b Ryc. 92. Duplikacja genów haptoglobiny w procesie ewolucji: a - allele haptoglobiny HPlF i HPls; b - nierówne crossing-over między HplF i fioss p# jako sposób powstania H (wg Smithiesa). tomstwa. Jeżeli teraz liczba potomstwa osób z fenyloketonuriš będzie taka sama jak w populacji kontrolnej, to można orzec, że przestaje działać selekcja prze„vr fenyloketonurii, nie zostajš natomiast wyeliminowane mutacje w kierunku tego zaburzenia. Tak więc zostaje zaburzona równowaga między mutacjš a selekcjš, częstoœć zespołu będzie rosła z pokolenia na pokolenie. Gzęstoœć genu fenyloketonur wynosi obecnie ok. 1 na 100. Można obliczyć, że do podwojenia tej częstoœci, to znaczy osišgnięcia q =-, niezbędne będzie 1 50 100 pokaleń, tzn. 3000 lat. Widać zatem, jak powoine sš tutaj procesy dysgeniczne. Można twierdzić, że wzglšd na nie nie powinien wpływać na formułowanie zadań polityki służby zdrowia w tej dziedzinie. PODSUMOWANIE Genetyka populacyjna zajmuje się zachowaniem się genów w populacjach. Podstawowym pojęciem jej jest częstoœć genu, podstawowym prawem zasada Hardy'ego i Weinberga. Zasada ta ustala stosunki między częstoœciami genów a częstoœciami genotypów w populacji krzyżujšcej się w sposób losowy. W populacji takiej częstoœć poszczególnych genotypów jest prostš funkcjš częstoœci genów (nAa : n,na : lZaa = p= : 2pq : q=). W populacji znajdujšcej się w równowadze częstoœć genu nie ulega zmianie z pokolenia na pokolenie. Zasada Hardy'ego i Weinberga pozwala na ocenę ezęstoœci genu na podstawie oceny częstoœci genotypu recesywnego. Głównym Ÿródłem homozygot w populacji sš heterozygoty. Podstawowymi czynnikami odpowiedzialnymi za odchylenia od równowagi genetycznej sš: mutacja, migracja, selekcja, spokrewnienie. Różnice w przystosowaniu biologicznym różnych genotypów mogš tłumaczyć występowanie w populacji polimorfizmów, m.in. polimorfizmu zrównoważonego. Postęp cywilizacji może wpływać zarówno na osłabienie, jak i na zaostrzenie selekcji naturalnej. XII. Immunogenet#ka A#na Czlon,ko#wska OdpowiedŸ immunologiczna powstajšca w wyniku kontaktu organizmu z antygenem może przejawiać się jako reakcja humoralna lub komórkowa. Limfocyty i makrofagi biorš udział w procesach odpornoœciowych. OdpowiedŸ immunologiczna humoralna zwišzana jest z wytwar'Laniem przeciwciał, których obecnoœć można wykazać w surowicy krwi i płynach ustrojowych. Pod wpływem stymulacji antygenowej małe limfocyty B przekształcajš się w plazmocyty, zdolne do syntezy i wydzielania przeciwciał. Reakcje immunologiczne typu komórkowego zwišzane sš z pojawieniem się uczulonych limfocytów T. Wytwarzajš one mediatory reakcji immunologicznych (limfokiny) lub biorš bezpoœredni udział w reakcjach cytotoksycznych. Ten typ odpowiedzi immunologicznej zwišzany jest z powstaniem nadwrażliwoœci typu póŸnego, a więc reakcji, takich jak np. nadwrażliwoœć kontaktowa, odrzucanie przeszczepu, reakcja tuberkulinowa. Funkcjonowanie układu immunologicznego determinowane jest przez odrębne grupy genów: 1. Geny kodujšce wolne immunoglobuliny oraz receptory immunoglobulinowe limfocytów B. 2. Geny wchodzšce w skład głównego układu zgodnoœci tkankowej. Warunkujš one rozpoznawanie komórek układu immunologicznego między sobš i ich różnicowanie. 3. Geny kodujšce receptor dla antygenów na limfocytach T. GENEłYCZNA KONłROLA SYNłEZY IMMUNOGLOBULIN BUDOWA IMMUNOGLOáULIN Podstawowš jednostkš immunoglobuliny jest tetramer składajšcy się z dwóch łańcuchów ciężkich (heavy chain - H), tej samej klasy, oraz dwóch identycznych łańcuchów lekkich (light chain - L) tego samego typu. Powišzane sš one ze sobš za pomocš wišzań dwusiarczkowych (ryc. 93). Masa czšsteczkowa łańcucha ciężkiego wynosi 55 000 - 72 000 w zależnoœci od klasy, a w jego skład wchodzi ok. 440 aminokwasów. Istnieje 5 klas łańcuchów ciężkich: gamma, alfa, mi, delta, epsilon. Masa czšsteczkowa łańcucha lekkiego wynosi 23 000, składa się on z 211 - 221 aminokwasów. Istniejš dwa typy łańcuchów lekkich: kappa i lambda. Klasa immunoglobuliny okreœlana jest przez rodzaj łańcucha ciężkiego. U człowieka immunoglobulina klasy IgG ma łańcuch gamma, klasy IgM 190 tahcuch lekki CzęœE hiperzmierma VL CL Łań ciężl„ cięż q5 s S CH# --5-s-- Częœć hiperzmierma -s-s - Czgœć zowia5own Czgœ E wiqżqea dopetniacz C 2 Mos&i H #, Wg9ta#adon dwusiarczkowe CH3 Ryc. 93. Schemat budowy czšsteczkI immunoglobuliny klasy G (wg Benacerrafa i Unanue 19?9). łańcuch mi, klasy IgA - alfa, klasy IgD - delta, klasy IgE - epsilon. Czšsteczka immunoglobuliny każdej klasy zawiera parę identycznych łańcuchów ciężkich oraz parę identycznych łańcuchów lekkich. Charakterystyka i rola poszczególnych klas immunoglobulin podane sš w tab. 41. ł a b e 1 a 41. Charakterystyka Immunoglobulin człowieka Klasa Stężenie w Masa Okres pół- Łańcu- Lańcu- Charakterysurowicy czšsteczkowa trwania chy lek- chy cięż- styczne m /100 ml) (dni) kie kie właœciwoœci l g IgG 900-1800 160 000 18-23 K i L gamma Precypityny Antytoksyny Wišzanie do- pełniacza PóŸne prze- ciwciała 5-6,5 K i L alfa Ochrona po- IgA 156--294 170 000 wierzchni i polimery K i L mi Aglutyniny IgM 67-145 960 000 5 Opsoniny Lizyny Wišzanie dopełniacza Wczesne przeciwciała IgD 0,3-40 184 000 2,8 K i L delta Nieznane IgE 10-130 188 105 2,3 K i L epsilon Reaginy Według Roitta, 1978. Każdy łańcuch zarówno „ężki, jak i lekki składa się z częœci zmiennej V (variable), stanowišcej częœć N-terminalnš łańcucha, oraz z częœci stałej C (constant), stanowišcej częœć C-terminalnš łańcucha. Częœć zmienna zawiera od 100 do 120 reszt aminokwasowych łańeucha. Decyduje ona o swoistoœci przeciweiała i w jej obrębie znajduje się miejsce wišzania antygenu. W częœci zmiennej istnieje częœć hiperzmienna, w której zmiennoœE sekwencji aminokwasów jest szczególnie duża. Pozostałš częœć oticinka zmiennego można zaszeregować w poszczególne podklasy, i tak: łańcuch kappa ma 4 podklasy, a łańcuch lambda - 5 podklas. Każdy łańcuch dzieli się na regiony (domeny) zawierajšce po ok. 110 aminokwasów. Około 60 aminokwasów każdego 191 regionu tworzy pętle, połšczone mostkami dwusiarczkowymi. Łańcuchy lekkie majš dwie takie pętle, łańcuchy ciężkie gamma i alfa - cztery, a mi, epsilon i delta - pięć. Każdy region warunkuje jednš z funkcji biologicznych przeciwciała. Regiony w obrębie VL (częœć zmienna łańcucha lekkiego) i Vc (częœć zmienna łańcucha ciężkiego) tworzš miejsca wišzania deterxninant antygenowych. Regiony CHs i CL majš prawdopodobnie działanie stabilizujšce, regiony CH# i CHs odpowiedzialne sš za wišzanie dopełniacza i zdolnoœć przyłšczania do receptorów komórki. Czšsteczka immunoglobuliny jest rozbijana przez enzymy proteolityczne na fragmenty o różnych właœciwaœciach biologicznych. Pod wpływem papainy czšsteczka ulega rozbiciu na 3 fragmenty. Dwa z nich nazywajš się wišżšcymi antygen, czyli Fab (fragment antigen binding), majš one masę czšsteczkowš 45000. Trzecim jest fragment Fc, ulegajšcy krystalizacji (fragment crystalizable) o masie czšsteczkowej 55 000. Immunoglobuliny klasy IgG, IgD i IgE sš czšsteczkami monomerycznymi. Czšsteczka IgM jest pentamerem. Struktura polimeryczna IgM tworzy się przez wišzania dwusiarczkowe i polipeptyd łšczšcy J. IgA występuje w dwóch zasadniczych formach molekularnych. W surowicy krwi występuje w formie monomerycznej, natomiast w płynach sekrecyjnych w formie dimeru. Dwie czšstki IgA sš wišzane przez polipeptyd łšczšcy J i tzw. czšstkę sekrecyjnš, charakterystycznš dla IgA. DEłERMINANłY ANłYGENOWE IMMUNOGLOBULIN Czšsteczka immunoglobuliny jest białkiem, w zwišzku z tym ma ona wiele determinant antygenowych. W zależnoœci od ich charakteru wyróżnia się determinanty izotypowe, allotypowe i idioty#owe (tab. 42). Izotypia. Wszystkie łańcuchy ciężkie oraz łańcuchy lekkie zawierajš wspólne determinanty antygenowe obecne u wszystkich osobników danego gatunku. Okreœlane sš one mianem determinat izotypowych. Surowica królicza skier4- wana przeciwko determinancie izotypowej łańcucha ciężkiego będzie swoiœcie rozpoznawała czšsteczki IgG obecne u wszystkich ludzi. Allotypia. Determinanty antygenowe w obrębie łańcuchów ciężkich lub lekkich, które znajdujš się tylko u częœci populacji danego g#atunku, nazywa się allotypowymi. Na przykład łańcuch kappa z leucynš w pozycji 191 ma determinantę allotypowš InV2, a łańcuch ten z walinš w tej samej pozycji - determinantę InV3. U człowieka zostało zidentyfikowanych w obrębie łańcucha gamma ok. 20 allotypowych determinant. Okreœlane sš one mianem znaczników (markerów) Gm i sš obecne głównie we fragmencie Fc. Znaczniki Gm obecne sš tylko w czšsteczce immunoglobuliny klasy IgG. W przeciwieństwie do tego czynnik Km (okreœlany dawniej jako InV) obecny jest w łańcuchu lekkim kappa każdej z klas immunoglobulin. Allotyp Am stwierdzony jest tylko w obrębie subklasy IgA2. Znaczniki allotypowe zostały również stwierdzone u królikó## i myszy. Podlegajš one kontroli genetycznej przez allele kodominujšce. Idiotypia. Idiotypowe determinanty antygenowe powstajš w wyniku szczególnej konfiguracji aminokwasów tworzšcych miejsca wišzania antygenów i zlokalizowane sš w częœci hiperzmiennej. Determinanty idiotypowe stwierdza się również na powierzchni limfocytów B i T - jako częœć receptora dla antygenu, jak również na produktach wydzielanych przez te komórki. 192 ł a b e 1 a 42. ZmicnnoœE e#- obrębic immunoglobutin VH/VL CHICL _I I Idiotyp Izotyp Izotyp I I Hiperzmien- Allotyp noœE #wišzanie antygenu) łyp m en- ftozpowszechnienie Odmiana Lokalizacja Przykłady Izotypia Wszystkie odmiany Klasy Cx IgM,IgE obecne w surowicy Subklasy Cx IgAl,IgA2 u normalnych Typy CL osobników. Podtypy CL Podgrupy Vx/VL Allotypia Alternatywne ior- Allotypy głównie Gm grupy (czło-my: genetycznie Cx/CL wiek) b4,b5,b6, uwarunkowane, czasami b9(królicze łań-nieobecne u wszy- VH/VL cuchy lekkie) stkich osobników. Idiotypia Specyficzne dla Idiotypy obszar Prawdopodobnie każdej czšsteczki zmienny jeden lub więcej immunoglobuliny. hiperzmiennych obszarbw tworzš- cych miejsce wiš- zania antygenu Według Roitta, 1978. Wykry„e swoistoœci idiotypowej i reakcji kizyżowych, w których biorš udział idiotypy, dało Jernemu podstawę do zaproponowania teorii sieciowej regulacji odpowiedzi immunologicznej, a następnie modyfikacji tej teorii przez innych badaczy. GENY ODPOWIEDZIALNE ZA SYNłEZĘ PRZ#CIWCIA# W organizmie ludzkim, podobnie jak zwierzęcym, mogš być syntetyzowane przeciwciała przeciwko nieżliezonej liczbie antygenów. Każde przeciwciało ma odrębnš swoistoœć, a więc budowę. Z wszystkich teorii tłumaczšcyeh, w jaki sposób dochodzi do tak dużej zmiennoœci w obrębie przeciwciała, najpopularniejsze były, ale obecnie majš już tylko znaczenie historyczne, teorie instruktażowa i selekcji klonalnej. Według teorii instruktażowej podstawowe znaczenie w ukształtowaniu czšsteczki immunoglobuliny miał mieć antygen, który spełniałby rolę matrycy. Czšsteczka immunoglobuliny po zetknięciu się z antygenem przybierałaby okreœlony kształt. Teoria ta upadła wtedy, gdy okazało się, że specyficznoœć prze„wciała nie zależy od konfiguracji białka, ale od sekwencji aminokwasów. 13 - Zarys genety# 193 01 #012# rł 1 # H 4 _ # #NA' :in# '3 L V1L V2 L V3 J 1 2 zarodkowej ge#y CH L V1 L V202 3 4 #`#A limfocyta B funkcjonalny gen VD J Ryc. 94. W skład egzonu (VDJ genu) zlokalizowanego w loci łańcucha ciężkiego wchodzš trzy segmenty które koduje region VH. Gen VDJ składa się z jednego spcœród kilkuset genów V, jednego spoœród dwunastu segmentów D i jednego z czterech segmentów J. Przykład ilustruje jednš spoœród wielu tysięcy możliwych ;rekombinacji (wg Roitta i wsp. 1985). Według teorii selekcji klonalnej organizm miał wytwarzać wszystkie prze#ciwciała, niezależnie od tego, czy uprzednio był kontakt z danym antygenem, :czy nie. Przeciwciała te miały występować w minimalnych iloœciach i dopiero po kontakcie z antygenem następowałoby powstanie kompleksu, który stymulowałby syntezę specyficznego przeciweiała. Teorię tę rozwinšł póŸniej Burnet, który uważał, że synteza specyficznego przeciwciała odbywa się na poziomie komórkowym. Obecnie przyjmuje się, że olbrzymia zmiennoœć w zakreœie czšsteczki immunoglobulin uwarunkowana jest polimorficznym układem genów kodujš#cych łańcuehy ciężkie i lekkie. Strukturalne geny immunoglobulin umiejscowione sš w trzech nie powišzanych ze sobš autosomalnych locż (zwane również translokonami): dla łań-cucha lekkiego lambda, dla łańcucha lekkiego kappa i dla łańcucha ciężkiego #(u człowieka leżšce odpowiednio na chromosomie 22 2 i 14). Loeż te okreœlane -sš jako złożone, ponieważ zawierajš liczne geny kodujšce fragmenty DNA #(egzony) poprzedzielane nie kodujšcymi sekwencjami DNA (introny). Częœć zmienna łańcucha lekkiego kodowana jest przez dwa geny: V i J (joining - łšczšcy), a łańcucha ciężkiego przez trzy geny: V, D (diversity - różnorodny) i J. Do każdego z genu V przylega gen L (leader) kodujšcy odcinek niezbędny w czasie transportu przeciwciała przez błonę. Częœć stałš łańcuchów lekkich koduje gen C kappa albo C lambda, a łańcu,chów ciężkich geny C dla poszczególnych typów immunoglobulin. W procesie modyfikacji potranskrypcyjnej dochodzi do uformowania się fragmentu RNA kodujšcego jeden łańcuch ciężki, zbudowany z fragmentów #VDJC, lub lekki, zbudowany z fragmentów VJC. Tak więc jeden łańcuch ciężki kodowany jest przez jeden spoœród kilkuset genów V, jeden spoœród `kilkdziesięciu genów D, jeden spoœród kilku genów J i gen C (ryc. 94). Zmiana w powišzaniu między genami kodujšcymi częœć zmiennš a genami #kodujšcymi częœć stałš prowadżi do syntezy przeciwciał o tej samej specyficznoœci, ale należšcych do odmiennych klas i podklas. Zjawisko to, zwane przełšczaniem klas immunoglobulin, polega na zmianie wytwarzanej przez dany klon komórkowy immunoglobuliny, np. IgM na IgG, bez zmiany syntetyzowanej częœci zmiennej łańcucha ciężkiego. Niedojrzałe limfocyty B wykazujšce ekspresję IgM pod wpływem bodŸca antygenowego mogš różnicować œi# do komórek plazmatycznych. wytwarza#šcych i wydzielajšcych przeciwciała w dużych iloœciach. Liczne badania wyka2ały, że limfocyty B w trakcie różnicowania przełšczajš, czyli zmien?ajš eks i94 presję cz꜄ stałej łańcucha ciężkieg# bez zmiany częœci zmiennej. Proces przełšczania nie obejmuje łańcucha lekkiego, którego ekspresja pozostaje niezmieniona. Ze względu na niewystępowanie zmian w częœciach zmiennych czšsteczki immunoglobuliny swoistoœć antygenowa przeciwciała podczas przełšczania klas zostaje utrzymana. Zjawisko przełšczania klas może zależeć od delecji odcinków DNA zawierajšcych geny #la częœci stałych łańcuchów ciężkich, co w rezultacie prowadzi do ekspresji kolejnych genów CH. Wyłšczanie alleliczne w zakresie allotypii. Znaczniki allotypowe obecne w obrębie czšsteczki immunoglobizlin sš determinowane przez allele kodominujšce. Dziedziczenie allotypii podlega prawom Mendla. Ekspresja allotypii na poziomie komórki podlega zjawisku okreœlanemu mianem wyłšczenia allelicznego (allelić exclusion). Homozygota ma pewnš determinantę allotypowš w obrębie wszystkich czšsteczek immunoglobuliny, np. klasy IgG, natomiast u heterozygoty ten marker będzie występował tylko na ok. połowie czšsteczek kršżšcych IgG. Komórki plazmatyczne zdolne sš bowiem do syntezy tylko jednego łańcucha z jednym znacznikiem allotypowym, mimo że komórka ma dwa geny kodujšce dwa różne znaczniki allotypowe. Jeden z genów pozostaje nieaktywny. Zjawisko wyłšczania allelicznego w przypadku immunoglobulin jest jedynym przykładem tego fenomenu zachodzšcym w zakresie chromosomów auto= somalnych. Zjawisko to było uprzednio znane jedynie w przypadku cech ko= dowanych genami w chromosomach płciowych. W komórkach somatycznych potomstwa żeńskiego jeden z chromosomów X ulega inaktywacji we wczesnym okresie rozwoju embrionalnego. Ten nieaktywny chromosom może pochodzić zarówno od matki, jak i ojca. Wydaje się, że zjawisko wyłšczania allelicznego też następuje przypadkowa i utrzymuje się w całym potomstwie danej komórki. Nie wiadomo, czy wyga= szanie aktywnoœci poszczególnych genów następuje na poziomie chromosomalnym, czy też na poziomie selekcji allotypu. Komórki syntetyzujšce przeciw= ciała u osób heterozygotycznych sš więc mozaikš fenotypowš. Różnorodnoœć w zakresie częœci zmiennej łańcucha immunoglobuliny. Według teorii selekcji klonalnej komórka jest pobudzona do syntezy przeciwciał przez okreœlony antygen. Jednakże problem, w jaki sposób zakodowana jest informacja pozwalajšca na syntezę takiej nieograniczonej liczby przeciwciał, nie jest wyjaœniony. Za spećyficznoœć przeciwciała odpowiedzialna jest częœć zmienna łańcuchów. a zwłaszcza częœć hiperzmienna. Wysunięto wiele teorii tłumaczšcych powstanie niezliczonej liczby miejsc wišżšcych antygen. Teoria lin zarodkowej (wielogenowa) zakłada, że w czasie rozwoju filogenetycznego następowała kolejna duplikacja genów, która doprowadziła stopniowo do wykształcenia przeciwciał o takiej budowie, jakš obserwuje się u człowieka. Jednakże bardzo często nie udaje się wykazać dziedzicznego przekazywania genów częœci zmiennej. W ostatnich latach wykazano, że mutacje somatyczne powstałych po rearanżacji genów immunoglobulinowych majš ważne znaczenie w dodatkowym zwiększaniu różnorodnoœci przeeiwciał. Mutacje somatyczne obejmujš mutacje punktowe, konwersje genu lub powstanie nowego genu VH lub VL. Mutacje somatyczne sš charakterystyczne głównie dla wtórnej odpowiedzi immuno= logicznej. Innš możliwoœciš jest rekombinacja somatyczna. W częœci genomu zachodzi intensywna wymiana i przetasowanie odcinków genów przez rekombinacjęDNA. Obecnie uważa się, że wszystkie te trzy wyżej wymienione mechanizmy biorš udział w procesie prowadzšcym do różnorodnoœci przeciwciał. 195 .#NłYGENY GI#UPOWE Pierwsze #rupowe antygeny tkankowe zostały opisane przez Landsteinera na poczštku obecnego stulecia. Badania na układami grupowymi krwinek czerwonych stały œię podstawš do poznania wielu tkankowych antygenów grupowych znajdujšcych się nie tylko na krwinkarh czerwonych, ale i na powierzchni innych koxnórek. Wszystkie one podlegajš kontroli genetycznej i zdolne sš do wywoływania reakcji immunologicznych. 'ł a b e 1 a 43. Układy grupowe krwi u człowieka Rok odkrycia # Układ # Najczęstsze antygeny lub grupy 1900 ABO AI,Az,B,0 1927 MNss M,N,S,s 1927 0 pl,px 1939 Rh D,C,c,E,e 1945 Lutheran Lua,Lub 1946 Kell K,k 1946 Levis Lea,Leb 1950 Duffy Fy#,Fyb 1951 Kidd Jka,Jkb 1954 Diego Dia,Dib 1956 Cartwright Yta,Ytb 1956 I I,i 1962 Xg 1965 Dombrock Doa,Dob 1965 COltOn COa,COb #1#edług Mohna, 1979. -#GRIłpy KRWI ##Człowiek ma wiele ńiezależnych od siebie układów grupowych krwinek czerwonych. Każdy z tyeh układów zawiera swoiste antygeny uwarunkowane .albo allelami zajmujšcymi jedno miejsce genowe albo całymi zestawami genów zajmujšcych blisko siebie leżšce locż. Z wszystkich układów grupowych krwi największe znaczenie z punktu wi;dzenia klinicznego majš układ ABO i Rh. Odgrywajš one ważna rolę w transfuzjologii i sš najczęstszš przyczynš zespołów hemolitycznych. Układ AB0. Wyróżnia się on spoœród innych układów grupowych tym, że przeciwciała przeciw antygenom tego układu stanowiš stały składnik surowicy krwi (izoprzeciwciała). Na podstawie obecnoœci na błonie krwinek dwóch antygenów (A i B) oraz po stwierdzeniu w surowicy przeciwciał skierowanych do tych antygenów zostały wydzielone cztery grupy układu AB0. Układ ABO dziedziczy się według praw Mendla. Jest on warunkowany genami allelicznymi. Ten typ dziedżiczenia okreœlany jest mianem allelizmu ł a b e 1 a 44. Układ grupowy ABO Genotyp Fenotyp Przeciwciała 00 0 anty-A, anty-B AA, AO A anty-B BB, BO B anty-A AB AB -iss wielukrotnego. Geny A i B sš daminujšce w stosunku do genu 0 i kodominujšce w genotypie AB. Prowadzi to do powstania 6 różnych genotypów. Częstoœć występowania poszezególnych grup krwi w różnych grupach rasowych jest różna. Bud#wa biochemiczna antygenów A i B jest doœe dobrze pomana. Antygeny te mogš być wyizolowane z krwinek czerwonych i znajdujš się w dwóch frakejach: rozpuszezalnej w alkoholu i rozpuszezalnej w wodzie. We frakeji rozpuszezalnej w alkoholu sš obecne glikosfingolipidy, a w rozpuszezalnej w wodzie gl:koproteiny zawierajšce dużš iloœć cukrów. Mimo że czšsteczki zawarte w obu frakejach majš odmiennš burlowę, charakteryzuje je bardzo zbliżona lub identyezna swoistoœć antygenowa i sš uwarunkowane tymi samymi allelarni. Specyficznoœć antygenowa jest wynikiem obecnoœci cukrów zajmujšcych najbardziej powierzehowne częœci makroczšsteczek. W œlinie zarówno osób grupy 0, jak i osób grupy A i B znajduje się substancja okreœlana mianem H. Uważa się, że jest ona prekursorem substaneji A i B. Badania struktury glikoproteinowych determinant warunkujšcych specyficznoœe czšsteczek A. B i H doprowadziły do stwierdzenia, że w loeus A B i H kodowane sš specyficzne enzymy pozwalajšce na przyłšczenie reszt cukrowych. W procesie syntezy substaneji grupowych przedostatnim etapem syntezy łańcucha węglowodanowego jest przyłšczenie L-fukozy katalizowane przez a-2-I,-fukosyltransferazę. Enzym ten kodowany jest w locus H. O specyficznoœci H decyduje L-fukoza. Ostatni etap przyłšczania reszty N-acetylogalaktozaminy lub reszty galaktozy katalizuje dwie specyficznoœci transferazy kodowane w locus AB. O specyficznoœci antygenu A decyduje N-acetylogalaktozamina, a o antygenie á-galaktoza. W zależnoœci od mocy antygenu A lub B wyróżnia się wiele odmian grupy A i B, np. A., A2, An. A,, Am, B#, Bm. Ciekawym zjawiskiem jest sporadycznie występujšcy fenotyp "Bombay". Allelem dla genu H jest rzadko występujšcy gen h. U osób homozygotycznych hh nie dochodzi do powstania substaneji prekursorowej H. W locus h nie jest kodowana a-#-fukozotransferaza lub też aktywnoœć produktu tego genu jest bardzo mała. Nie dochodzi więc do przyłšczenia L-fukozy i powstania substaneji H. Mimo że transferazy kodowane w miejscu genowym A lub B majš pelnš aktywnoœć, substaneje grupowe nie mogš być syntetyzowane. Krwinki czerwone tych osób nie reagujš z surowicami wzoreowymi, w œlinie brak zarówno substaneji H, jak i A lub B. W surowicy natomiast, poza izoaglutyninami anty-A i anty-B, obecne sš również aglutyniny anty-H zlepiajšce krwinki grupy 0. Osoby z fenotypem "Bombay" przekazujš właœciwy im gen grupowy następnemu pokoleniu, w którym ujawnia się prawidłowa grupa krwi (wobec rzadkoœ„ genu h iœtnieje duże prawdopodobieństwo, że partner osoby z fenotypem hh będzie miał gen H w podwójnej dawce). Substaneje grupowe układu ABO obecne sš w minimalnych iloœciach we wszystkich tkankach z wyjštkiem nerwowej. U ok. 80o/a ludzi rasy kaukaskiej w œlinie i innych płynach ustrojowych, z wyjštkiem płynu mózgowo-rdzeńiowego, znajduja się substaneje A, B i H. Nazywani sš oni wydzielaczami. Wydzielanie uwarunkowane jest parš genów niezależnš od układu AB0. Gen Se jest dominujšcy w stosunku do swojego allela se. Osoba majšca zestaw genów sese nie wydżiela żadnych substaneji grupowych. Geny A i B odpowiedzialne sš za przekształcenia się substaneji H w substaneje grupowe A czy B. Dlatego też w œlinie osób grupy 0 znajduje się więcej substaneji H niż w œlinie osób A czy B. Układ fth. Antygenem o największym znaczeniu klinicznym jest antygen D. W rasie białej 85o/o populacji jest Rh (D) dodatnimi, pozostali nie majš tego antyganu i nazywani sš Rh (D) ujemnymi. Osoby Rh ujemne nie majš prze 197 eiwciał anty-D, mogš je wytworzyć po immunizacji, np. w wyniku mylnego przetoczenia krwi lub cišży (płód Rh dodatni). W układzie fth znajdujš się trzy pary genów allomorficznych C i c, D i d, E i e sprzężonych ze sobš i zajmujšcyeh trzy miejsca w jednym chromosomie. Obecnoœć ich okreœla 8 kombinacji genowych, a mianowicie: cde, CDe, cDE, Cde, cdE, cDe, CDE, CdE. Geny te determinujš obecnoœć antygenów, które wykrywa się za pomocš zestawu surowic odpornoœciowych. U osób rasy białej najczęœciej występujš zestawy genowe cde, cDe i eDE. Pozostałe kombinacje genowe występujš tylko u niespełna 10#/o populacji. Zawartoœe antygenu D na krwinkach czerwonych u poszczególnych ludzi jest różna. Istnieje pewna współzależnoœć pomiędzy genotypem Rh a nasileniem antygenu D. Antygen D wyrażony mocniej niż przeciętnie spotyka się na krwinkach osób o genotypie cDe/cDE, antygen D o przeciętnej mocy występuje u ludzi o genotypie cDE/cde i CDe/cde. Podobnie jak w układzie AB0, istnieje wiele odmian antygenów D, C i E. šKŁAD ZGODNOŒCI TKANKOWEJ Po raz pierwszy główny układ zgodnoœci tkankowej (major histocompatibility complex - MHC) został zidentyfikowany na powierzchni leukocytów krwi obwodowej u człowieka. Stšd też układ ten u człowieka powszechnie nazywany jest HLA, od angielskich słów human leukocyte antigens (ludzkie antygeny leukocytarne). Badania nad tym układem rozpoczęto w poczštkach lat pięćdziesištych, kiedy to stwierdzono u osób, które były poddawane wielokrotnym przetaczaniom krwi, obecnoœć przeciwciał przeciwleukocytarnych. W tym czasie największe zainteresowanie układ ten budził wœród transplantologów. Stwierdzono, że czas utrzymania się przeszczepionego narzšdu jest znacznie dłuższy, jeżeli narzšd ten pochodzi od rodzeństwa identycznego pod względem układu HLA, niż jeżeli pochodzi od przypadkowo dobranego dawcy. Wkrótce okazało się, że układ HLA ma znaczenie nie tylko dla transplantologii, ale również dla procesu immunoregulacji. Ta ważna rola locż układu zgodnoœci tkankowej w procesie immunoregulacji została potem wielokrotnie potwierdzona zarówno na modelach zwierzęcych, jak i u ludzi. Wiele podstawowych badań dotyczšcych struktury i funkcji MHC było przeprowadzonych na wsobnych szczepach zwierzšt. Układ ten u zwierzšt, a zwłaszcza u myszy, jest pod wieloma względami podobny do układu u ludzi, tak że badania doœwiadczalne mogły stać się podstaw# do poznania tego systemu. Genetyczne podstawy układu HLA Geny kodujace układ HLA znajdujš się na krotkim ramieniu chromosomu 6 i zajmujš odcinek długoœci ok. 3 cM (centimorganów). Układ HLA (i jego odpowiedniki u zwierzšt), idiotypowe determinanty immunoglobulin oraz geny kodujšce łańcuch receptora dla antygenu komórek T stanowiš najbardziej polimorficzne systemy genetyczne. Układ MHC jest podzielony na regiony A, B, C i D, które zawierajš odmienne locż HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D. Antygeny A, B i C sš to tzw. antygeny transplantacyjne, należšce do klasy I antygenów MHC, a genetyczne produkty tych locż sš dziedziczone jakc cechy autosomalne dominujšce. Cišgle poznawane sš nowe allele kodujšce układ HLA. Obecnie w loc# HLA-A i HLA-B znajduje się 70 dobrze zdefiniowanych specyficznych alleli, a w locż HLA-C osiem. Oprócz tego istnieje wiele specyficznych antygenów 198 c:hrcmo5cm 6 ńomp,eks IJLA C4,#C2 B ':#5#' 1# ; ; (..,'t ##:, SB#< 58# DC<< DC#j C4F C4 #Ć = I 1 DR< DR, C 2 Bt I I < ii #00### b;atka /pcfipeptydy Ryc. 95. Geny układu HLA u człowieka. Geny układu HLA zlokalizowane sš na 6 chromosomie. W regionie B, C i A zakodowane sš czšsteczki antygenów klasy I układu MHC, w regionie D zakodowane sš łańcuchy L i B białek klasy II SB, DC i DR (majš odpowiednio specyficznoœci DP, DQ i DR). W obszarze pomiędzy D i B zakodowane sš składniki C9 i Cz dopełniacza oraz czynnik Bf (wg Roitta i wsp. I585). niezupełnie zdefiniowanych, przy których w klasyfikacji międzynarodowej dodaje się literę "w". W miarę doskonalenia metod identyfikacji okazuje się, że niektńre allele, uprzednio uważane za pojedyncze, zawierajš 2, a ezasem więcej alleli. W regionie HLA-D wyodrębniono trzy główne, dobrze okreœlone serie produktów które oznaczono symbolami HLA-DR, HLA-DQ (dawna seria MB) i HLA-DP (dawna seria SB). Okreœlone sš one jako antygeny zgodnoœci tkankowej I1 klasy. Serie HLA-DR i HLA-DQ oznaczone sš przeważnie za pomoeš metod serologicznych, natomiast produkty serii HLA-DP wykrywane sš dotychczas jedynie za pomocš testu pobudzonych limfocytów (PLł). Niektórzy uważa#š, że DR, DQ i DP sš różnymi, ale bardzo blisko siebie leżšcymi locż. Nie można jednak wykluczyć, że metodš serologicznš i w teœcie pobudzonych limfocytów wykrywa się jedynie inne determinanty tego samego produktu tego samego genu. W obrębie MHC mapujš się również geny warunkujšce hemochromatozę samoistnš i niedobór 21-hydroksylazy (powodujš#y wrodzflny przerost nadnerczy). W obrębie MHC znajdujš się również locż, któr# k#ntrolujš syntezę czynnika C2 i C4 dopetniacza, okreœlane także jako układ MHC klasy III oraz czynnika B properydyny (Bf). Zaburzenia równowagi spowodowane s#rzężeniem (linkage disequilibrium). Zgodnie z prawem Hardy'ego i Weinberga, w dużej populacji, podlegajšcej kojarzeniu przypadkowemu. rozpowszechnienie poszczególnych genów determinujšcych danš cechę powinno z czasem stać się równomierne i nie ulegać zmianie. Ten stan równowagi nie ulega zachwianiu tak długo, jak dlugo nie zaistnieje jakiœ proces dodatkowy, który prowadzi do selekcji. Prawdopodobieństwo wspólnego występowania genów znajdujšcych się w tym samym chromosomie może być teoretycznie wyliczone na podstawie znanej częstoœci występowania genów. I tak np. częstoœć genu Al jest 0,16, a B8 0,10. Haplotyp AlBB powinien znajdować się u 1,6a/o całej populacji (0,16 X 0,10). Jednakże w populacji rasv białej częstoœć haplotypu AlBB wynosi 7,8#o, to jest 4,5 razy częœciej, niż wynikało z teoretycznych wyliczeń. Występowanie haplo 199 typów genowych znacznie częœciej, niż wynikałoby to z tenretycznyeh wyliczeń, okreœla œię mianem odchylenia od równowagi na skutek sprzężenia. Oznacza się je jako 0, gdzie 0 = obserwowana częstoœć danego haplotypu minus teoretyczna częstoœć danego haplotypu. Odchylenie od równowagi na skutek sprzężenia jest bardzo częste w układzie HLA. Nie jest do tej pory jasne, dlaczego właœnie w układzie HLA zjawisko to występuje tak często. Niektórzy uważajš, że jest to wynikiem migracji ludnoœci. Do jednej populacji przybywa inna populacja, która zaburza stan równowagi. Inni uważajš, że jest to wynikiem selekcji naturalnej. Niektóre układy genowe stwarzajš pozytywne, irme negatywne cechy, które rzutujš na przetrwanie. Struktura biochemiczna układu HLA Produkty genów układu HLA znajdujš się na powierzchni niemal #vszystkich komórek (z wyjštkiem HLA-D). Struktura biochemiczna antygenów HLA-A, B i C jest zbliżona, natomiast HLA-D odmienna od pozostałych. Antygeny HLA-A, B i C sš glikoproteinami. Cigżki Heta - Z - ta5cuch mikrogl 000) l12.000l tańcuch alfa # Beta ( 33 000 d I I 28. 000 d 1 CHO CHO S CHO Y ĆHO Ryc. 86. Schemat przedstawiajšcy strukturę czšsteczki antygenu a) HLA-A, B i C oraz b) Btona kombricbwa HLA-D (wg Rodeya a C#-# b isei). Czšsteczki antygenów zgodnoœci tkankowej I klasy zbudowane sš z dwóch ł#ńcuchów polipeptydowych. Łańcuch ciężki przechodzi przez błonę komórkovrš. Jego zewnętrzna częœć zawiera trzy domeny (at, a7, a ) uformowane przez wišzania dwusiarczkowe. Lekki łańcuch B#- mikroglobuliny kodowany na chromosomie 15 jest niekowalencyjnie zwišzany z łańcuchem ciężkim. Sekwencja aminokwasów w obrębie czšsteczek A, B i C jest w 80 - 85o/o identyczna. W domenach u# i az (leżšcych najbardziej zewnętrznie) homologia sekwencji aminokwasów wynosi poniżej 50o/o i jest to obszar, który decyduje o allogenicznym polimorfizmie. Czšsteczki klasy II MHC zawierajš dwa niekowalencyjnie zwišzane łańeuchy polipeptydowe a i á. Każdy z nich ma dwie domeny uformowane przez wišzania dwusiarczkowe. 200 Funkcja układu IfLA Funkcja układu HLA i jego produktów na powierzchni komórek jest przedmiotem bardzo intensywnych badań. Decydujšcym momentem w poznawaniu roli tego układu w procesie immunoregulacji było stwierdzenie, że do aktywacji komórek immunokompetentnych przez obcy antygen potrzebny jest nie tylko syg'nał pochodzšcy od tego antygenu, ale też sygnał pochodzšcy od własnego antygenu obecnego na powierzchni komórki prezentujšcej obcy antygen. Większoœć własnych antygenów jest właœnie zakodowana w układzie HLA. Rozpoznanie antygenu #bcego w stosunku do antygenów HLA-A, B „ C prowadzi do aktywacji komórek cytotoksycznych i supresorowych. Cytotoksyczne komórki T gospodarza mogš zabijae własne komórki zakażone wirusem i komórki majšce obce powierzchniowe antygeny (komórki przeszczepu). Aby komórki cytotoksyczne przejawiały swe działanie, konieczna jest obecnoœć na komórce docelowej (zakażonej wirusem, przeszczepie) co najmniej jednego allelu należšcego do układu HLA-A lub B wspólnego z gospodarzem. Geny i produkty determinujšce układ HLA-D majš bardziej złożone zadanie w procesie immunoregulaeji. Antygeny powierzchniowe należšce do tego układu sš antygenami bardzo silnymi. Poœredniczš one w reakcjach pomiędzy komórkami T i B, pomiędzy makrofagami a komórkami T i - prawdopodobnie - pomiędzy makrofagami a komórkami B. Na modelach doœwiadczalnych u myszy wykazano, że antygeny, które odpowiadajš ludzkim HLA-D, odgrywajš podstawowš rolę w rozwoju i funkcjonowaniu komórek T pomocniczych (ł helper - Tn). Antygeny klasy II występujš na komórkach prezentujšcych antygen (najczęœciej makrofagi) i umożliwiajš rozpoznanie antygenu przez limfocyty T pomocnicze. U myszy w obrębie układu MHC, w częœci odpowiadajšcej ludzkiemu HLA- D, zlokalizowano geny, które nazwano genami odpowiedzi immunologicznej. U myszy sš one w regionie I układu H-2. Geny odpowiedzi immunologicznej regulujš wielkoœć i charakter reakcji. Immunizacja różnych szczepów myszy czy œwinek morskich prostymi syntetycznymi zwišzkami lub małymi dawkami złożonych antygenów białkowych - pozwoliła na wyodrębnienie szczepów, u których odpowiedŸ immunologiczna była bardzo silna, i szczepów, u których była bardzo slaba. Analiza segregacyjna wykazała, że silna odpowiedŸ immunologiczna dziedziczy się jako cecha dominujšca. Wydaje się, że geny Ir (geny odpowiedzi immunologicznej kontrolujšce wielkoœć reakcji) oraz geny Is (I supressor, kontrolujšce zahamowanie reakcji) sprawujš głównš kontrolę nad limfocytami T, a te dopiero nad komórkami B poprzez komórki Th i TS). Geny bioršce udział w procesach immunoregulacji obecne sš również u ludzi i przypuszcza się. że sš one zlokalizowane w obrębie częœci D układu HLA. # Rola u#ładu HLA w patogenezie chorńb W ok. 40 różnych chorobach stwierdzono skojarzenie pomiędzy nimi a występowaniem niektórych antygenów należšcych do układu HLA. Najbardziej jaskrawym przykładem tego zjawiska jest większa częstoœć występowania antygenu HLA-B27 w niektórych chorobach reumatycznych, a zwłaszcza w zesztywniajšcym zapaleniu stawów (spondylitis atzkylopoet#ica). Choroba ta często występuje rodzinńie. Antygen B27 stwierdzony jest u 7o/o ludnoœci europejskiej, a wœród chorych ze zesztywniajšcym zapaleniem stawów występuje w 80 - 90o/o. Gdy oblicza się względne ryzyko choroby, okazuje się, 201 że wœród osób z antygenem B27 jest ono 87 razy większe niż w populacji ogólnej. Również u chorych z zapaleniem jagodówki, zespołem Reitera, odczynowym zapaleniem stawów częstoœć występowania antygenLi B27 jest większa. Postać jedno- lub kilkustawowa typ I młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów (częœciej występuje u dziewczšt) wykazuje asocjację z HLA-DR5, DRw6 i DRwB, podczas gdy typ II (częœciej występuje u chłopców) kojarzy się z HLA-B27. Szczególna forma młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów z zapaleniem tęczówki jest skojarzona z antygenem DR5. Podobnie antygen B27 występuje często u osób z formš oœrodkowš zapalenia stawów z łuszczycš, a antygen Bw38 jest skojarzony z formš oœrodkowš i obwodowš tej choroby. Natomiast u chorych ze zwyrodniejšcym zapaleniem stawów lub dnš nie wykazuje się żadnych skojarzeń. Występowanie hemachromatozy samoistnej jest bardzo œciœle skojarzone z antygenem HLA-A3. Większoœć innych chorób jest skojarzona z antygenem układu HLA-D. Na przykład choroba trzewna cechuje się częstym występowaniem antygenu DR3 (ryzyko względne = 21). Antygen występuje wœród 64 - 96o/o chorych, a w populacji ogólnej u 22 - 27o/o. Cukrzyca młodzieńcza insulinozależna (typ I) często występuje u osób z antygenem DR4 i DR3 i jest ujemnie sprzężona z antygenem DR2. Cukrzyca rozwijajšca się u osób dorosłych nie jest sprzężona z układem HLA. Rzadki allel Bf jest stwierdzany u 17 - 25o/o przypadków cukrzycy młodzieńczej. Nadczynnoœć tarczycy w Stanach Zjednoczonych jest skojarzona z antygenem B8, Dw3, a w populacji japońskiej z Bw35. Czasami układ HLA jest skojarzony tylko z jakšœ podgrupš chorych z danym zespołem. Tak np. 7n.yasthenża gravżs bez grasiczaka jest silnie skojarzona z antygenami B8 i DR3, a stwardnienie rozsiane o przebiegu ostrym z DR2. Mechanizm występowania skojarzeń pomiędzy chorobami a układem HLA nie jest jasny. Można dopatrzyć się kilku cech, które sš wspólne dla tych chorób. Większoœć chorób skojarzonych z układem HLA ma pewne lub prawdopodobne podłoże autoimmunologiczne. Do chorób, w których patogenezie proces autoimmunologiczny odgrywa pewnš rolę, zaliczamy 7n,yasthetzża gravżs, toczeń rumieniowaty uogólniony i tyreotoksykozę. Chorobami, które majš bardzo prawdopodobne tło autoimmunologiczne, sš: cukrzyca młodzieńcza, przewlekłe aktywne zapalenie wštroby, reumatoidalne zapalenie stawów, choroba trzewna, zespół Sj”rgena, choroba Addisona o niegruŸliczej etiolog. Następnš cechš wspólnš jest to, że choroba rozwija się tylko u małej grupy osób noszšcych dany antygen HLA. Trzeciš wspólnš cechš jest to, że nie wszyscy pacjenci chorujšcy na chorobę majš ten charakterystyczny antygen. Wœród różnych teorii tłumaczšcych powišzanie chorób z układem HLA najczęœciej rozważane sš następujšce możliwoœci: 1. Struktura układu HLA (MHC) może być identyczna lub bardzo zbliżona do struktury antygenu (antygenów) czynnika infekcyjnego (wirusa). Dopóki zachowana jest tolerancja na własne antygeny, czynnik ten jest eliminowany przez mechanizmy immunologiczne. 2. Niektóre antygeny # układu HLA mogš reagować krzyżowo z przeciwciałami skierowanymi przeciw antygenom wirusowym czy bakteryjnym. Powoduje to dołšczenie się reakcji autoimmunologicznej do istniejšcej już choroby. 3. Antygeny układu HLA mogš stanowić miejsce wišzania lub receptor dla mikroorganizmów lub ich antygenáw i w ten sposób doprowadzać do destrukcji tkanki w wyniku działania mechanizmáw immunologicznych. 202 4. Geny odpowiedzi immunologicznej kodowane przez locus (loci) w bliskim sšsiedztwie regionu D mogš podlegać mutacjom. Prowadzić to może do zaburzeń w czynnoœci komórek regulujšcych odpowiedŸ immunologicznš, s tym samym do procesu autoimmunizacji. 5. W obrębie układu HLA znajdujš się geny odpowiedzialne za syntezę składników dopełniacza. Defekt w obrębie tych genów może prowadzić do powstania choroby autoimmunologicznej. 6. W bliskim sšsiedztwie genów układu MHC mogš znajdować się geny, których produkty nie sš zwišzane z reakcjš immunologicznš, ale które sš odpowiedzialne za powstanie niektórych chorób. Powišzanie pomiędzy specyficznym fenotypem HLA i chorobš w takim przypadku może być wynikiem odchylenia od równowagi na skutek sprzężenia. W przypadku choroby Gravesa i Basedowa stwierdza sit skojarzenia nie tylko z antygenami układu HLA, ale także z genami determinujšcymi budowę allotypowš immunoglobulin. Przy tym szczególnym powišzaniu danego antygenu HLA z allotypiš immunoglobuliny zachorowalnoœć na chorobę Gravesa i Basedowa jest znaeznie większa, niż gdy rozpatruje się tylko układ HLA. Okreœlenie antygenów HLA, allotypii immunoglobulin łšcznie z innymi genetycznymi znacznikami i czynnikami œrodowiskowymi może w przyszłoœci pozwolie na bardzo dokładne okreœlenie ryzyka choroby i mieć zastosowanie w poradnictwie genetycznym. GENY KODUJA#CE ftECEPłOR DLA ANłYGENU NA LIMFOCYłACH T W rozpoznawaniu antygenu przez komórki T poœredniczy receptor o specyficznoœci dla danego antygenu (łcR lub Ti). TcR zbudowany jest z dwóch łańcuchów polipeptydowych a i á. Czšsteczki a i á TcR majš zbliżonš sekw- #ncję aminokwasowš i sš strukturalnie podobne do łańcuchów lekkich i ciężkich immunoglobuliny. Łańcuch á TcR zawiera 4 oddzielnie kodowane regiony V, D, J i C, a łańcuch a przynajmniej trzy regiony V, J i C. Geny kodujšce łańcuchy a i á majš podobnš organizację jak geny kodujš#e lekkie i ciężkie łańcuchy immunoglobulin. Rodzina genów kodujšcych łańcuch á znajduje się na chromosomie 7, a rodzina genów dla łańcucha a znajduje się na chromosomie 14. W czasie dojrzewania limfocytów T dochodzi do rearanżacji genów, czego następstwem jest synteza kompletnej czšstki TcR. PODSUMOWANIE Reakcje humoralne i komórkowe stanowiš podstawowe rodzaje odpowiedzi immunologicznej. Te dwa typy odczynowoœci immunologicznej sš ze sobš œciœle powišzane, ale podlegajš kontroli genetycznej regulowanej przez trzy odrębne układy genowe: 1) geny strukturalne, warunkujšce syntezę łańcuchów immunoglobulin, 2) geny wchodzšce w skład głównego układu żgodnoœci tkankowej (MHC), 3) geny kodujšce receptor dla antygenu na limfocytach T (łcR). Synteza łańcuchów immunoglobulin regulowana jest przez 3 rodziny genów: 1) geny syntetyzujšce łańcuchy lekkie lambda, 2) łańcuchy lekkie kappa i 3) łańcuchy ciężkie. Geny odpowiedzialne za syntezę częœci stałej i częœci zmiennej (warunkujšcej swoistoœć przeciwciała) sš odmienne. Różne powiš 203 zania pomiędzy tymi układami genów prowadzš do olbrzymiego polimorfizmu czšstećzek immunoglobulin. Geny układu MHC (u człowieka układ HLA) kontrolujš ekspresję antygenów tkankowych na powierzchni komórek i procesy immunoregulacji. Geny i produkty regionów A, B i C układu HLA grajš głównš rolę w zjawisku odrzucania przeszczepu, podczas gdy region D bierze również udział w procesie immunoregulacji. W obszarze tym zlokalizowane sš geny odpowiedzi immunologicznej, które warunkujš wielkoœć i charakter reakcji immunologianej. Rożpoznawanie antygenu przez komórki T odbywa się przy wspóludziale receptora specyficznego dla danego antygenu. Geny kodujšce łańcuch a i (i tego receptora majš podobnš organizację jak ge#ny kodujšce łańcuchy lekkie i ciężkie immunoglobulin. XIII. Farmakogenet#ka i ekogenet#k# Ign,acy Wald PODSłAWOWE POJ#CIA Farmakogenetyka jest to dyscyplina z pogranicza genetyki i farmakologii: Zajmuje się uwarunkowanš genetycznie zmiennoœciš reakcji na œrodki farma= kologiczne. Nietypowe reakcje niektórych osób na œrodki farmakologiczne, zwłaszcza w przypadkach chorób dziedzicznych, mano od doœć dawna (np: porfiria lub niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej). Dopiero jednak od lat pięćdziesištych bieżšcego stulecia badania nad tymi zagadnieniami stałyů się oddzielnš dyscyplinš naukowš. Wspomniana zmiennoœć może dotyczyć zarówno losów leku w organizmi# (farmakokinetyka), jak i jego działania na organizm (farmakodynamika). Zachowanie się leku w ustroju jest wielostopniowe i rozkłada się na szereg faz. Mamy więc do czynienia z wchłanianiem leku, jego dystrybucjš, biotransformacjš, interakcjš z receptorem, sprzęganiem i wydzielaniem. Każda z tych przemian sterowana jest przez układy enzymatyczne, których synteza jest programowana genetycznie. Zmiennoœć w DNA, kodujšcym informacje dla enżymów sterujšcych poszcze= gólnymi fazami przemiany leku w organizmie, prowadzi do uwarunkowanej genetycznie zmiennoœci. Około 30o/o białek, m.in. białek enzymatycznych, wykazuje u człowieka polimorfizm genetyczny, można więc oczekiwać dużego# odsetka zmiennoœci typu genetycznego w białkach wpływajšcych na leki. Po= nieważ los leku w organizmie zależy od różnych procesów sterowanych ge= netycznie, można oczekiwać, że w wielu przypadkach zmiennoœć parametrów farmakokinetycznych będzie mieć charakter wieloczynnikowy (ryc. 97). W przypadkach uzależnienia wieloczynnikowego wskaŸnikiem roli czynników genetycznych jest współczynnik odziedzirzalnoœci. Jeżeli zmiennoœć przemiany leku lub reakcji organizmu na lek zależy głównie od zmiennoœcx w jednym locus genowym, to mówi się o kontroli jednogenowej. Jeżeli okreœlimy rozkład jakiegoœ parametru farmakologicznego w populacji, np. ustalonego stężenia leku lub stężenia leku po okresie jego półtrwania, to krzywa o charakterze jednomodalnym, zbliżona do rozkładu normalnego, przemawia raczej za wieloczynnikowym uwarunkowaniem tej zmiennoœci. Krzywa dwu- lub trójmodalna œwiadczy raczej o kontroli zmiennoœcl przez jedno miejsce genowe. Wielomodalnoœć w tych przypadkach pochodzi stšd, że inna jest reakcja organizmu homozygot lub zachowanie się leku w ich organizmie dla jednego genu, a odmienna reakcja u osobników z genem allelicznym. Może się niekiedy zdarzyć, że rozkład krzywej w populacji ma charakter jednomodalny, choć zależy od pojedynczego genu. Dwumodalnoœć 205- Ÿtyc. 99. Rozklad parametru farmakokinetycznego w populacji w zależnoœci od typu uwarunkowania genetycznego. Na osi odciętych parametr farmakokinetyczny lub farmakodynamiczny, na osi rzędnych liczba osobników: a - krzywa dwumodalna charakterystyczna dla dziedziczenia jednogenowego z dominacjš; b - krzywa trójmodalna charakterystyczna dla dziedziczenia kodominujšcego; c - krzywa jednomodalna mogšca œwiadczyć o wieloczynnikowym uwarunkowaniu cechy. występuje dopiero wówczas, gdy oddzielnie analizuje się wyniki w poszcze.gólnych rodzinach. Ekogenetyka jest dyscyplinš w jakimœ sensie pochodnš farmakogenetyki: termin ten powstał w 1971 r. Obejmuje ona badania nad uwarunkowanš genetycznie zmiennoœciš reakcji organizmu na różne czynniki œrodowiska zewnętrznego. Mogš to być więc substancje znajdujšce się we wdychanym powietrzu, w wodzie, w pokarmach itd. WARIANłY JEDNOGENOWE I WIELOCZYNNIKOWE Defekt dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej. Jest to cecha sprzężona z chromosomem X, przy której nieprawidłowe działanie dehydrogenazy glukozo-6--fosforanowej prowadzi do nieprawidłowych reakcji na leki. Stosowanie wielu leków powoduje niedokrwistoœć hemolitycznš. Należš do nich m.in. sulfonamidy i œrodki ehinolinowe. Znamy obecnie wiele wariantowych odmian genu dehydrogenazy 6-fosforanowej; występujš one najczęœciej w populacjach żyjšcych nad Morzem Œródziemnym, w Afryce i w Azji. Przypuszcza się, że częstoœć genów patologicznych podtrzymywana była w #opulacjach na skutek zrównoważonego polimorfizmu wywołanego większš flpornoœciš heterozygot na malarię tropikalnš. W niektórych postaciach reakeje hemolityczne występujš nie tylko po spożyciu leków, lecz również niektórych pokarmów, np. bobu (fawizm). Pseudocholinoesteraza. Zmiennoœć w zakresie tego enzymu została wykryta w badaniach reakcji na œrodki zwiotczajšce mięœnie typu suksametonium. W warunkach prawidłowych działanie œrodków zwiotczajšcych pochodnych kwasu bursztynowego jest krótkie i chory wraca do stanu normalnego. Czaœami jednak długotrwałe zwiotczenie mięœni prowadzi do bezdechu. Sytuacje takie wymagajš specjalnego postępowania reanimacyjnego. Okazało się, że patologiczna reakcja na leki wywołana jest nieprawidłowym genem pseuocholinoesterazy. Normalny gen oznacza się E 1 . Geny nieprawidłowe bywajš rozmaite. Najczęstszy gen Ei Częstoœć g2nów nieprawidłowych w populacjach europejskich wynosi ok. 1 na 60, tzn. 1,5o/o. Częstoœć homozygotycznoœci E; wynosi ok. 1 na 3500. Opornoœć enzymu na œrodki zwiotczajšc# jest zazwyczaj równoległa do jego opornoœci na dibukainę. Dlatego na ogół charakteryzuje się enzym odpowiedniš liczbš dibukainowš. 206 Acetylacja hydrazydu kwasu izonikotynowego. Unieczynnianie hydrazydu# przebiega przez acetylację leku. Gen szybkiej acetylacji leku jest dominujš= cy w stosunku do genu acetylacji powolnej. U osób homozygotycznych od= noœnie do genu acetylacji powolnej (tzn. powolnyeh unieczynniaczy) jest wię= ksza skłonnoœć do występowania powikłań pod wpływem hydrazydu lub; œrodków zbliżonych. U powolnych unieczynniaczy jest większa częstoœć występowania drgawek lub polineuropatii pod wpływem leku. Zmiennoœć w tym zakresie zależy od enzymu N-acetylotransferazy. Acetylacja dotyczy również i innych leków, jak hydrala2yna, prokainamid, fenelzyna, niektóre# sulfamidy i zwišzki diazepinowe. Nie jest jasne, czy enzymy te sš identyczne, czy występuje tu wysoka swoistoœć enzymu w stosunku do substratu. Zauważono, że toczeń rumieniowaty uogólniony częœciej występuje u powolnych unieczynniaczy hydralazyny lub prokainamidu. Zespół hipertemii złoœliwej. Zespół ten występuje u niektórych chorych poddawanych znieczuleniu ogólnemu. Uważa się, że œrodki do znieczulania ogólnego, m.in. halotan, u osobników wrażliwych mogš wywołać ciężkš reakcję przejawiajšcš się bardzo wysokš temperaturš, zaburzeniami elektrolitowymi, stwarzajšcš bardzo istotne niebezpieczeństwo dla życia chorego: Zespół ten, zwišzany prawdopodobnie z nieprawidłowoœciš w budowie włókien mięœniowych chorych, przekazuje się jako cecha autosomalna dominujšca. Polimorfizm paraoksonazy* surowiczej. Osoby z dużš aktywnoœciš paraoksonazy majš większe szanse przeżycia w przypadkach zatruć parationem, paraoksonem i niektórymi innymi inhibitorami cholinoesterazy. Zmiennoœć w tym zakresie również zależy od jednego miejsca genowego. Z innych cech farmakologicznych, których uwarunkowanie prawdopodobnie zależy od jednego genu, można wymienić defekt hydroksylazy fenytoiny, defekt hydroksylacji amobarbitalu, opornoœć na warfarynę. Z innych zespołów charakteryzujšcych się jednoczynnikowo uwarunkowanš zmiennoœciš należy wymienić akatalazję oraz skłonnoœć do powstawania methemoglobinem pod wpływem acetofenetydyny. ł a b e 1 a 45. Odziedziczalnoœć niektórych parametrów farmakokinetyeznych OdziedziLek/œrodek Badan arametr czalnoœć Fenazon Fenylbutazon Dikumarol Etanol Fenytoina Lit, po dawce 300 mg co 12 godzin Salicylan sodu 40 mg/kg dożylnie Kwas acetylosalicylowy 65 mg/kg doustnie okres pbłtrwania w osoczu 0,99 okres pbłtrwania w osoczu 0,99 okres pbłtrwania w osoczu 0,98 prędkoœE znikania z osocza przy dawce 0,98 1ml na 1kg masy ciała okres półtrwania w surowicy 0,85, stężenie w osoczu 0,8# prędkoœE znikania z surowicy 0,86 ustalony poziom kwasu salicylowego 0,98 w surowicy '" Inna nazwa enzymu to arylosulfataza. 207 Ób#awy pozapiramidowe w przebiegu leczenia chloropromazynš. Istnieje #wiele danych wskazujšcych na to, że skłonnoœć do występowania objawów „pozapiramidowych u osób leczonych pochodnymi fenotiazyny jest uwarunkowana genetycznie. Skłonnoœć ta była obserwowana również u członków ro:dzin probandów, u których stwierdzono również samoistne występowanie :zaburzeń pozapiramidowych. Tryb przekazywania dziedzicznego nie jest jed#nak u tych osób dokładnie ustalony. Uwarunkowania wieloczynnikowe. Niektóre parametry farmakokinetyczne #nie wykazujš prostego uwarunkowania genetycznego, badania nad bliŸniętami przemawiajš za ich uwarunkowaniem wieloczynnikowym. Tabela 46 #wymienia niektóre z tych parametrów. :LEKI A CiiOROBY UWARUNKOWANE GENEłYCZNIE W wielu chorobach, m.in. chorobach uwarunkowanych genetycznie, może wy#stępować nietypowa reakcja na leki. Leki mogš m.in. wpływać zaostrzajšco na przebieg choroby. ł a b e I a 46. Leki wywołujšce napad porfir przerywanej Lp. Nazwa Lp. # Nazwa 1 Barbiturany 13 Hydantoiny 2 Bemegrid 14 Izopropyldipyron 3 Chloramfenikol 15 Metyldopa 4 Chlordiazepoksyd 16 Meprobamat 5 Chlorpropamid 17 Pentazocyna #6 Diazepam 18 Pochodne sporyszu ? Dichloralfenazon 19 Progestyny 8 Estrogeny 20 Sedormid 9 Fenazon 21 Sukcynimidy 10 Fenobarbital 22 Sulfafenazol 11 Glutetymid 23 Sulfamidy 12 Gryzeofulwina 24 Tolbutamid Klasycznym przykładem zakieg6 zaburzenia jest porfiria ostra przerywana - zespół autosomalno-dominujšcy, zależy od defektu syntazy porfobilino#enowej. Bardzo wiele leków może wywołać w tej chorobie eiężki zespół zaburzeń somatycznych, neurologicznych i psychicznych (tab. 46). Podobnie œrodki moczopędne z grupy tiazydowej mogš wywołać zaostrzenie dny. Œrodki tiazydowe oraz kortykosteroidy mogš zaostrzać również przebieg cukrzycy. Niektóre zespoły niewydolnoœci mišższu wštrobowego ulegajš pogorszeniu po spożyciu alkoholu, zastosowaniu barwników do cholecystografii lub estro#enów. W dysautonomii rodzinnej (chorobie Rileya i Daya) charakteryzujšcej się m.in. zaburzeniami aktywnoœci hydroksylazy dopaminowej* stwierdza się nadwrażliwoœć na metacholinę. Podobnie w fenyloketonurii występuje nadmierna reakcja na aminy katecholowe. P4 ich podaniu następuje wzrost #ciœnienia tętniczego krwi. * Inna nazwa enzymu to á-monooksygenaza dopaminowa. 208 EKOGENEłYKA Ekogenetyka zajmuje się uwarunkowanš genetycznie zmiennoœciš reakcji na różne czynniki œrodowiska zewnętrznego. Jednym z najstarszych znanych typów takiej zmiennoœci jest wrażliwoœć na smak fenylotiomocznika. Niektóre osoby oceniajš tę substancję jako gonkš, dla innych ma smak obojętny. Okazało się, że jest to cecha uwarunkowana genetycznie, zależna od jednej pary genów, przy czym cecha wrażliwoœci jest dominujšca w stosunku do niewrażliwoœci. Częstoœć genu T (wrażliwoœci) w populacjach europejskich wynosi 0,45, częstoœć t - 0,55. Zauważono, że osoby niewrażliwe na smak fenylotiomocznika majš większš skłonnoœć do niedoczynnoœci tarczycy. Innym układem wykazujšcym żmiennoœć u człowieka jest układ hydroksylazy węglowodorów aromatycznych. Stężenie tego enzymu znajduje się pod wpływem czynników genetycznych, chociaż dokładny tryb uwarunkowania nie jest ustalony. Stwierdzono, że osoby z dużš aktywnoœciš hydroksylazy węglowodorów aromatycznych majš więksżš skłonnoœć do występowania odoskrzelowego raka płuc, chodzi tutaj szczególnie o palaczy z tš cechš. Polimorfizm a-1-antytrypsyny. Zawartoœć a-1-antytrypsyny zależy od genów w jednym locus. Najistotniejszym genem jest gen PiM, częstoœć tego genu wynosi 0,9. Cecha PiM i PiS warunkuje dużš aktywnoœć a-1-antytrypsyny, inne allele powodujš zmniejszenie aktywnoœci. Homozygoty, a niekiedy i heterozygoty dla genu PiZ lub PiS, sš narażone na występowania chorób zapalnych, marskoœci lub nowotworów wštroby, a w wieku dojrzałym majš zwiększonš skłonnoœć do występowania zaporowej choroby płuc, zwłaszcza jeżeli palš lub przebywajš w œrodowisku zanieczyszczonym. Hipolaktazja. Cukier mleczny spożywany z pokarmami jest rozkładany w jelicie cienkim przez laktazę'. U ogromnej większoœci niemowlšt laktaza jest wytwarzana przez kosmki œcian jelita cienkiego. Po osišgnięciu dojrzałoœci u częœci osób wytwarzanie tego enzymu jest kontynuowane i nie majš one żadnej trudnoœci z trawieniem mleka słodkiego. U wielu osób jednak zdolnoœć do wytwarzania laktazy zanika, a nierzadko występuje nietolerancja na mleko słodkie. Prostym testem na przetrwałš czynnoœć enzymatycznš jest test tolerancji laktozy. Podaje się w nim 2 g laktozy na 1 kg masy eiała, nie więcej jednak niż 50 g. U osób z aktywnš laktazš, po podaniu laktozy zwiększa się zawartoœć glukozy we krwi. U osób z nietolerancjš laktozy wzrost taki nie następuje. Stwierdza się również zaburzenia jelitowe. Jest wiele przyczyn wpływajšcych na czynnoœć laktazy, najc2ęœciej jednak zmiennoœć w tym zakresie uwarunkowana jest genetycznie i zależy od jednego locus. Cecha tolerancji na laktozę jest dominujšca w stosunku do nietolerancji na ten cukier. Częstoœć genu przetrwałej laktazy jest różna w różnych populacjach. Jest ona duża w krajach skandynawskich (Szwecja 0,83, Finlandia 0,58), mała w krajach œródziemnomorskich (Grecja 0,31), na Bliskim Wschodzie (Liban 0,05) i na Dalekim Wschodzie (Chiny 0,01). Jest rzeczš interesujšcš, że w niektórych populacjach pasterskich w Arabii również stwierdza się dużš częstoœć genu przetrwałej lnktazy. Przypuszcza się, że częstoœć tego genu ulega ewolucji w zależnoœci od selekcji zwi#zanej z trybem życia populacji. ' Obecna nazwa enzymu to á-D-galaktozydazn. 1! - Znry# Qenetyk! 209 PODSUMOWANIE Farmakogenetyka i ekogenetyka zajmujš się zmiennoœciš genetycznš w reagowaniu odpowiednio na leki i inne czynniki œrodowiska zewnętrznego. W ostatnich latach wyrbżniono wiele rodzajbw takiej zmiennoœci, szczególnie ważna klinicznie jest zmiennoœć w zakresie cholinoesterazy rzekomej, dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej i innych. Różnice w prędkoœci unieczynniania niektórych lekbw, m.in. hydrazydu kwasu izonikotynowego, sš uwarunkowane genetyeznie. Ważne znaczenie kliniczne ma uwarunkowany genetycznie zespół hipertemii złoœliwej występujšcy u osobników wrażliwych na œrodki do znieczulania ogólnego, zwłaszcza halotan. Leki mogš wpływaE na przebieg niektórych chorób, w szczególnoœci znany jest wpływ leków jako czynników prowokujšcych napady porfirii ostrej przerywanej. Leki mogš wywierać wpływ prowokujšey również w cukrzycy i w dnie. Niektóre parametry farmakokinetyczne uwarunkowane sš genetycznie w sposób wieloczynnikowy. Zmiennoœć genetyczna we wrażliwoœci na różnorodne czynniki œwiata zewnętrznego może mieć ważne znaczenie biologiczne i kliniczne. Przykładami tego sš: defekt a-1- antytrypsyny, aktywnoœć arylosulfatazy węglowodorbw aromatycznych, hipolaktazj a. XIV. Poradnictwo genet#czne Prze#n.ysZa#w Czerski, E#a Maniko#wska-Czerska Poradnictwo genetyczne jest podstawowš metodš profilaktyki chorób genetycznych. Zarówno ze społecznego, jak i indywidualnego punktu widzenia, poradnictwo genetyczne ma p#dwójne znaczenie. Z jednej strony powinno ono prowadzić do zmniejszenia liczby chorych genetycznie, z drugiej zaœ strony umożłiwiać posiadanie zdrowych dzieci przez genetycznie obcišżone rodziny. Należy więc wskazać możliwe opcje i dopomóc w wykorzystaniu istniejšcych możliwoœci, przede wszystkim w zakresie leczenia, rehabilitacji i prenatalnej diagnostyki chorób genetycznych. Udziełenie porady wymaga ustalenia prognozy genetycznej. Polega ona na okreœleniu prawdopodobieństwa posiadania zdrowych dzieci (szans pozytywnych), dzieci przekazujšcych chorobę i chorych dzieci. Wielkoœć prawdopodobieństwa posiadania chorych dzieci jest miarš ryzyka genetycznego. Ustalenie prognozy genetycznej jest możliwe tyłko wówczas, gdy rozpoznanie jest szczegółowe, pewne i tok dziedziczenia choroby jest znany. Stšd działalnoœć poradni genetycznej obejmuje zazwyczaj weryfikację lub ustalenie rozpoznania. Bardzo istotnym elementem porady jest informacja o prognozie co do przebiegu choroby oraz o możliwoœciach leczenia i rehabilitacji. Toteż poradnictwo genetyczne wymaga rozległej wiedzy w zakresie genetyki klinicznej. Jednoczeœnie niezbędna jest znajomoœć zastosowania w genetyce teor prawdopodobieństwa oraz metod analizy statystycznej i matematycznej. Poradnictwo genetyczne wymaga więc wysokich kwalifikacji fachowych. Porada może być skuteczna tyiko wówczas, gdy zostanie w pełni zrozumiana i zaakceptowana przez pacjentów. Porada powinna im dopomóc w znalezieniu właœciwego ustawienia w trudnej, dramatycznej sytuacji życiowej. Niewłaœciwy sposób udzielenia porady może wyrzšdzić poważne szkody psychologiczne, doprowadzić do rozbicia rodziny, niewłaœciwego traktowania poszczególnych jej członków i ciężkich kryzysów emocjonalnych. C. O. Carter podkreœla, że poradnictwo genetyczne jest sztukš komunikowania się z ludŸmi, wymagajšcš szczególnych umiejętnoœci przekazywania informacji. Podstawowš zasadš jest uszanowanie godnoœci osobistej pacjentów, zrozumienie ich trudnej sytuacji i nienarzucanie swoich osobistych poglšdów. Trudno jest znaleŸE pojedynczš osobę majšcš wszystkie wymagane kwalifikacje. Poradnictwo genetyczne wymaga działalnoœci zespołowej. Obejmuje ona następujšce kolejne etapy: 1) weryfikację lub ustalenie rozpoznania, 2) ustalenie toku dziedziczenia choroby, 3) okreœlenie genotypu pacjenta#, " Zgodnie z definicjami podanymi w rozdziale X pacjentem jest osoba zasięgajšca porady genetycznej. 211 4) okreœlenie prognozy genetycznej, 5) udzielenie porady, 6) pomoc w uzyska- niu odpowiedniej opieki, 7) weryfikację skutecznoœci porady, wyników opie- ki i w miarę potrzeby udzielanie dodatkowych porad. Jest to działalnoœć długofalowa i może dotyczyć kilku pokoleń jednej rodziny. Nie2będna jest więc przejrzysta i szczegółowa dokumentacja. WERYFIKACJA LUB USłALENIE ROZPOZNANIA Rozpoznanie kliniczne jest oparte na cechach fenotypu. Jak to omówiono w rozdziale I, możliwoœć wnioskowania na tej podstawie jest ograniczona i zależy od dokładnoœci metody opisu fenotypu. Toteż w poradnictwie genetycznym nie można przyjšć rozpoznania bez znajomoœci danych, na podstawie których zostało ono ustalone. Najczęœciej proband jest innš osobš niż pacjent, który zazwyczaj ma prawidłowy fenotyp. Podstawš rozpoznania obcišżenia genetycznego i wnioskowania o genotypie pacjenta sš więc w znacznej mierze dane wywiadu rodzinnego. Muszš one bye zweryfikowane przez uzyskanie miarodajnej dokumentacji medycznej lub osobiste zbadanie probanda oraz, w miarę potrzeby i możliwoœci, innych członków rodziny. Każdy lekarz, niezależnie od specjalnoœci, musi umieć przygotowywać odpowiedniš dokumentację. Zależy ona od rodzaju choroby i dla każdej poszczególnej jednostki musi być inna. Można jednak podać pewne ogólne uwagi co do podstawowych wymogów: 1. Dokumentacja nie musi być obszerna, musi podawaE tylko istotne dane, uwzględniajšce zawsze rozpoznanie (podejrzenie), podstawę rozpoznania i charakterystykę przebiegu choroby. 2. Rozpoznanie musi być konkretne i okreœlać jednostkę chorobowš. Sformułowanie typu "opóŸnienie rozwoju", "encefalopatia", "wielowadzie" itp. nic nie mówiš, mogš być raczej uważane za przyczynę skierowania w celu ustalenia rozpoznania. 3. Podstawa rozpoznania może być często sformułowana lakonicznie, jeżeli do rozpoznania wystarczajš wyniki badań laboratoryjnych, np. oznaczenia biochemiczne lub kariotypu. Należy zawsze podać dane iloœciowc i metodę (np. przy wyniku kariotypu, jakie metody barwień pršżltowych były stosowane). Jeżeli podstawš do rozpoznania były anomalie struktury i/lub zewnętrzne cechy budowy, opis musi być bardziej szczegółowy. 2aden opis nie zastšpi dokumentacji fotograficznej. 4. Charakterystyka przebiegu choroby powinna podawać wiek, w którym pierwsze objawy choroby zostały zauważone przez chorego lub jego otoczenie, wiek w chwili zwrócenia się pn poradę z powodu tych objawów i lakonicznš charakterystykę przebiegu choroby w okresle obserwacji. 5. Wiele chorób genetycznych ma fenokopie indukowane czynnikami œrodowiska, jak np. niedorozwój umysłowy lub zabunenia neurologiczne zwišzane z urazami okołoporodowymi albo zespoły wywołane zakażeniem lub podaniem zwišzków chemicznych w czasie cišży. Aby orzec istnienie zwišzku przyczynowego pomiędzy czynnikiem œrodowiska i chorobš, należy wykazać, że czynnik ten rzeczywiœcie występował w odpowiednim okresie. Stšd pedantyczna i szczegółowa dokumentacja przebiegu cišży i porodu jest niezbędna dla póŸniejszych rozważań diagnostycznych. Rozpoznanie chorób metabolicznych opiera się na wykazaniu i okreœleniu odpowiedniego defektu molekularnego (patrz rozdział XV - Diagnostyka prenatalna). Niektóre z nich można bezpoœrednio stwierdzić tylko w okreœlonych komórkach, np. wštroby, w krwinkach czerwonych lub fibroblastach. 212 Rutynowe rozpoznanie choroby metabolicznej rzadko opiera się na bezpoœrednim badaniu defektu molekularnego, znacznie częœciej dokumentowane jest danymi poœrednimi, jak okreœlenie aktywnoœci enzymów, przesunięcia w zakresie metabolitów lub obecnoœć nieprawidłowych produktów, zmiany w cechach antygenowych lub odczynowoœci immunologicznej, zaburzenia w procesach krzepnięcia krwi, a nawet w cechach strukturalnych, jak np. obecnoœć krwinek sierpowatych, sferocytów itp. w hemoglobinopatiach. Tym bardziej konieczne jest dokładne okreœlenie podstaw rozpoznania. Choroby metaboliczne mogš wystšpić w różnym wieku. Mogš one ujawnić się od razu po urodzeniu i doprowadzić do œmierci w pierwszych dniach, miesišcach lub latach życia. Rzadko kiedy towarzyszš im oczywiste nieprawidłowoœci wyglšdu zewnętrznego. Podejrzenie choroby metabolicznej we wczesnym dzieciństwie wynika z różnych objawów. Pierwszym może być zahamowanie rozwoju psychomotorycznego, utrata nabytych już umiejętnoœci, trudnoœci w przyjmowaniu pożywienia, zahamowanie przyrostu masy ciała, wymioty, odwodnienie, kwasica, zmiany napięcia mięœniowego (hiper- lub hipotonia) i niekiedy drgawki. Nasilenie objawów może wahać się od drobnych, trudno uchwytnych, do dramatycznie narastajšcyeh zaburzeń. Szczegółowa kontrola stanu dziecka od chwili porodu (okreœlonego według skali Apgar) i okresowe badania we wczesnym okresie życia majš podstawowe znaczenie dla wczesnej diagnostyki chorób metabolicznych. Może pojawić się ciężka hepatosplenomegalia oraz zmiany w elektroencefalogramie. Choroba może przebiegać szybko i uniemożliwić szczegółowe rozpoznanie za życia. Dlatego niezbędne jest pobranie i zamrożenie próbek krwinek, osocza i surowicy krwi oraz moczu w celu przeprowadzenia odpowiednich badań biochemicznych. Zależnie od podejrzenia może być wskazane pobranie wycinka skóry i założenie hodowli fibroblastów in vitro uzyskanie i zamrożenie materiału z biopsji wštroby oraz pobranie próbek różnych narzšdów w czasie sekcji z uwzględnieniem możliwoœci potrzeby badań biochemicznych mózgu. Zasadniczymi objawami wczeœnie ujawniajšcych się chorób metabolicznych sš: żółtaczka, biegunka, wymioty, hipoglikemia, kwasica, specyficzny zapach ciała, moczu lub kału, nieprawidłowoœci owłosienia, apatia i œpišczka oraz drgawki. W póŸniejszym okresie dołšczajš się zaburzenia wzrostu i proporcji ciała, może wystšpić mikro- lub makrocefalia. Należy dodać, że objawy choroby metabolicznej zmieniajš się z wiekiem i że w póŸniejszym okresie charakteryzujš się one głównie niedorozwojem umysłowym, objawami neurologicznymi i zaburzeniami wzrostu oraz proporcji ciała. Majšc udokumentowane obciażenie rodowodu chorobš metabolicznš, można na podstawie wymienionych wyżej objawów starać się zidentyfikowae dotkniętych niš członków rodziny. Wiedzšc o istnieniu tych objawów i nie majšc biochemicznego rozpoznania, lekarz udzielajšcy porady genetycznej jest bezradny. Lekarz specjalista, majšcy do czynienia z tego typu objawami (najczęœciej pediatra), powinien wyjaœnić rozpoznanie, doprowadzajšc do badania chorego lub zabezpieczenia materiałów w oœrodku dysponujšcym odpowiednim zestawem metod biochemicznych. Rozpoznanie aberracji chromosomalnych może być oparte wyłšcznie na oznaczeniu kariotypu. Miarodajnoœć oznaczenia zależy od wybranej metody i typu badanych komórek. Odpowiednie dane powinny znaleŸć się w opisie wyniku badania. Wiele aberracji chromosomalnych łšczy się z bardzo charakterystycznym fenotypem (pattz rozdz. IV i V). Jednakże rozpoznawanie aberracji chromosomalnych wyłšcznie na podstawie cechy fenotypu jest błędem w sztuce. Trisomia 21 (zespół Downa) może służyć jako przykład. Aber 213 racja ta daje charakterystyczny fenotyp rozpoznawalny na pierwszy rzut oka, przykład typowej "diagnozy ulicznej". Charakterystyczny fenotyp jest rozpoznawalny w cišgu pierwszych 7 dni życia. Spotykaliœmy jednak przypadki kierowane po potwierd#enie rozpoznania w 3-4, a nawet 6 roku życia. Z naszych doœwiadczeń wynika, że w 1976 r. zespół Downa był "naddiagnozowany" w 15#/o. Błędne rozpoznanie tego typu piętnuje rodzinę i prowadzi do urazów psychicznych. Wreszcie ok. 4o/o przypadków stanowiš trisomie translokacyjne, w których ryzyko genetyczne jest wyższe niż w trisomiach regularnych. Obowišzuje zasada, że w przypadku podejrzenia aberracji chromosomalnych oznaczenie kariotypu jest niezbędne dla ustalenia rozpoznania i prognozy genetycznej. W klasycznym ujęciu podejrzenie aberracji autosomalnych nasuwa triada objawów: niedorozwój umysłowy, nieprawidłowoœci cech zewnętrznych głowy i budowy szkieletu, wada serca. W miarę gromadzenia obserwacji przekonano się, że rozpiętoœć cech fenotypu w aberracjach chromosomalnych jest bardzo duża i waha się od głębokich zaburzeń do normy. Z zasady aberracje aneuploidalne prowadzšce do dużych zmian w iloœci materiału genetycznego (trisomie lub monosomie całych chromosomów lub dużych ich odcinków) dajš głębokie zaburzenia. Nie jest to sztywna reguła, poważnš rolę odgrywa również treœć informacyjna chromosomu (odcinka), którego aberracja dotyczy. Obserwowaliœmy głębokie zaburzenia w częœciowych trisomiach chromosomu 21, w których aberracja dotyczyła bardzo niewielkiego odcinka. Obserwowaliœmy również pacjentkę 46,XX/47,XX,#-8, z mozaikš w stosunku 1:3, z prawie normalnym fenotypem. W aberracjach strukturalnych, które dotyczš odcinków chromosomów zawierajšcych okreœlone locus, można i należy uzupełniać opis cech anatomicznych odpowiednimi badaniami biochemicznymi potwierdzajšcymi występowanie pojedynczej lub potrójnej dawki genu (patrz rozdział VII - Dziedziczenie jednogenowe). Należy dodać, że u osób z euploidalnymi aberracjami chromosomalnymi, jak robertsonowskie i zrównoważone wzajemne translokacje chromosomów, fenotyp jest prawidłowy. Obserwowano również osoby z małymi, bliżej nie zidentyfikowanymi chromosomami znacznikowymi (markerowymi), majšce prawidłowy fenotyp. Rozpoznanie swoistych zespołów zwišzanych z anomaliami budowy anatomicznej jest trudne. Jeszcze trudniejsze jest uzyskanie dokumentacji pozwalajšcej na potwierdzenie lub ustalenie rozpoznania. Tradycyjna dokumentacja kliniczna i anatomopatologiczna nie uwzględnia opisu budowy anatomicznej w wystarczajšcym stopniu. Konieczny jest szczegółowy opis cech zewnętrznych. Najlepszš dokumentacjš sš fotografie. Konieczne sš zbliżenia głowy en face i z profilu. Te ostatnie muszš dobrze uwidoczniać uszy. Niezbędna jest fotografia całego ciała oraz zbliżenia dłoni i stóp. W przypadku dzieci zmarłych z wadami wrodzonymi niezbędne jest zdjęcie rtg całego koœćca oraz wynik badania sekcyjnego z uwzględnieniem głowy. Dane te powinny być uzupełnione pomiarami antropometrycznymi lub przynajmniej podstawowymi całego ciała. W opisie cech zewnętrznych należy szczególnš uwagę zwrócić na głowę. Ważna jest charakterystyka owlosienia i linii zarostu włosów. Niezbędne jest scharakteryzowanie kształtu czaszki przez odpowiednie pomiary, minimum stanowi pomiar obwodu głowy. Istotne jest osadzenie uszu i kształt małżowiny usznej. Ważnymi cechami sš kształt i ustawienie szpary powiekowej, rozstaw oczu i opis rogówki, Ÿrenicy, często soczewki i dna oka. Znaczenie ma kształt czoła, nasady nosa i budowa nosa. Dla wielu zespołów charakterystyczny jest kształt ust, odstęp pomiędzy nosem i ustazni, cechy podniebienia, kształt i ustawienie żuchwy, uzębienie. 214 Jeżeli nie ma fotografii i cech tych nie uwzględniono w opisie, to nie windomo, czy były one rozważane, toteż w opisie należy podawać dane negatywne. Ważne sš proporcje ciała, opis budowy tułowia i kończyn z uwzgIędnieniem charakterystyki palców. W przypadku urodzenia dziecka z wadami wrodzonymi i ze złym rokowaniem co do życia opis i fotografie należy sporzšdzić szybko, fotografie poœmiertne sš zazwyczaj mniej informujšce. W wielu przypadkaeh niezbędnym badaniem różnicowo-rozpoznawczym jest oznaczenie kariotypu. Należy więc szybko pobrać krew do tego badania lub wykonać biopsję skóry lub tkanki łšcznej bezpoœrednio po œmierci. Czytelne kariotypy można uzyskać z limfocytów œledziony w okresie 12-24 h po œmierci. USłALENIE TOKU DZIEDZICZENIA CHOROBY Po spełnieniu wstępnego podstawowego warunku, to jest zweryfikowaniu i ustaleniu rozpoznania choroby u probanda oraz uzyskaniu wiarygodnych danych o innych członkach rodziny, można przystšpić do ustalenia toku dziedziczenia. Ten zaœ stanowi podstawę do wnioskowania o genotypie pacjenta, a następnie opracowania prognozy genetycznej. We wszystkich trzech etapach obowišzujš te same zasady rozumowania, toteż trzy fragmenty poœwięcone tym etapom należy traktować łšcznie. Podział na etapy i podział tekstu został wprowadzony nieco sztucznie dla celów dydaktycznych. Zamiarem autorów było podkreœlenie koniecznoœci œcisłego, logicznego myœlenia i zdawania sobie sprawy z miarodajnoœci wniosków. Podstawę rozumowania stanowi informacja uzyskana z trzech Ÿródeł: 1) ogólne dane empiryczne o rozważanej chorobie i populacji (dane empiryczne), 2) teoretyczne dane o prawach dziedziczenia (dane teoretyczne), 3) konkretna informacja oparta na wynikach badania rozważanej rodziny (dane szczegółowe). Konfrontacja tych danych pozwala na wysnuwanie logicznych wniosków, których miarodajnoœć powinna być sprawdzona przez liczbowe okreœlenie prawdopodobieństwa lub przez empiryczne sprawdzenie. To ostatnie nie zawsze jest możliwe, gdyż może brakować odpowiednich metod. Prognoza genetyczna (końcowy wynik rozumowania) dotyczy zdarzeń, które jeszcze nie nastšpiły, jest bowiem przewidywaniem możliwe#o genotypu (fenotypu) dziecka przed poczęciem. Prognoza genetyczna jest więc zawsze probabilistyczna, weryfikacja empiryczna jest możliwa w przyszłoœci. ZASłOSOWANIE TEORII PRAWDOPODOBIEl#łSłWA W PORADNICłWIE GENEłYCZNYM Zastasowanie teorii prawdopodobieństwa w poradnictwie genetycznym zostało przedstawione w dużym skróeie i w sposób uproszczony. Szczegółowe rlane podajš Murphy i Chase (1975) w swoim podręczniku. Zajmujšc się poradnictwem genetycznym nie trzeba być biegłym matematykiem i statystykiem, należy jednak zdawać sobie sprawę z podstaw logicznych i matematycznych wnioskowania, prowadzšcego do ustalenia prognozy genetycznej. Z praktycznego punktu widzenia obliczanie prawdopodobieństwa do n znaku po przecinku nie ma znaczenia dla pacjenta, który jest zainteresowany w jakoœciowym raczej okreœleniu ponoszonego ryzyka jako małego, œredniego ż dużego. Liczbowe okreœlenie wielkoœci prawdopodobieństwa ma znaczenie teoretyczne i znaczenie dla samokontroli osoby udzielajšcej porady. Teoria prawdopodobieństwa zajmuje się dużymi liczbami zjawisk, których 218 występowanie uwarunkowane jest przypadkowo. Rozwnża się duży zbiór zjawisk. Poszczególne badane zjawiska można okreœlić jako zdarzenia elementarne. W rozważanym zbiorze okreœlone zdarzenie jest wynikiem poszukiwanym, jak np. urodzenie dziecka z trisomiš 21 wœród wszystkich żywych urodzeń, liczba zgonów na zawał serca wœród wszystkich zgonów itp. Prawdopodobieństwo jest ułamkiem, którego wartoœć waha się od zera do jeden. Prawdopodobieństwo 0 oznacza, że zdarzenie nie występuje. Prawdopodobieństwo 1 oznacza, że zdarzenie jest pewne. Prawdopodobieństwo można wyrażać jako ułamek zwykły, np. -, stosunek, np. 1 szansa na 2, 1 2 ułamek dziesiętny, np. 0,5 lub w procentach, np. 50o/o, albo rzadko - w promilach. Ustalenie prawdopodobieństwa na podstawie częstoœci występowania wymaga empirycznych danych statystycznych. W genetyce często używa się takich danych. Ustalono na podstawie wielu tysięcy dzieci, że częstoœć zespołu Downa wœród noworodków wynosi 1: 640. Stšd na podstawie rozumowania indukcyjnego można stwierdzić, że dla danej populacji istnieje prawdopodobieństwo 1 :640 (ryzyko populacyjne), iż następne urodzone dziecko będzie miało zespół Downa. Badajšc dzieci kobiet w poszczególnych grupach wiekowych stwierdzono, że œrednia częstoœć dzieci z trisomiš 21 jest różna. Odchylenia nd œredniej populacyjnej pozwoliły na wykazanie, że istnieje nieprzypadkowa zależnoœć pomiędzy wiekiem matki w chwili porodu a zespołem Downa. Wynika stšd, że œrednia częstoœć występowania zjawiska, a stšd i jego prawdopodobieństwo ustalone metodš indukcji, zależy od sposobu zebrania danych i ważne jest tylko w obrębie założeń logicznych i matematycznych danego ukladu doœwiadczeń. Sposobami zebrania danych, analizy ich przypadkowoœci lub zwišzków przyczynowych zajmuje się statystyka. W poradnictwie bardzo często korzysta się z takich danych statystycznych, jak częntoœć chorób genetycznych, częstoœć genów w populacji, częstoœć mutacj i itp. W analizie genetycznej rodowodów często rozumuje się a priori. Może istnieć zbiór zdarzeń, w którym liczba możliwych wyników jest skończona. Klasycznym tego przykladem jest rzut monetš, który ma dwa możliwe wyniki - orzeł lub reszka. Zakładajšc, że oba wyniki sš równouprawnione (moneta nie jest zgięta, sfalszowana w okreœlony sposób), prawdopodobieństwo dla każdego z nich jest takie samo - -. Otrzymanie jednego z 2 dwóch wyników - to jest albo reszki, albo orła - równa się jeden i jest zdarzeniem pewnym. Jeżeli oznaczyć wynik orzeł literš p, a wynik reszkaliter# q to można zapisać: p#-q=1 p=1-q p=q= 1 2 Prawdopodobieństwo uzyskania poszczególnych wyników w serii rzutu oparte jest na rozwinięciu dwumianu p -# q, jak to udowodnił Bernoulli. Dla dwóch rzutów dwumian należy podnieœć do kwadratu: stšd w omawianym przykładzie prawdopodobieństwo otrzymania dwóch (p -# q)' = p# -ł- 2pq #- q' kolejnych rzutów z wynikiem orzeł wynosi 1/4, z wynikiem reszka - tyle samo, a z wynikiem orzeł w jednym, a reszka w drugim 1/2. Prawdopodo Z16 0 1P #' 1 1 p2 -#- 2 p q, 3 1 p3 -i- 3 Pz q. -i- 3 Pq.2 #' 1 q. 4, 1p4 'Ÿ' 4p3q, T 6p2%z #' 4P%3 + # 1 p5 '# 5 p4 % '# 10 p 3 q,z '# 10 p 2 q,3 '# 5 p %4 "# 1 #L5 Ryc. 98. Trójkšt Pascala. Liczba wyrazów w rozwinięciu dwumianu wynosi n -#- I. Każdy nowy współczynnik w trbjkšcie otrzymuje się przez dodanie dwóch najbliższych wyrazów w wierszu wyżej, jak to pokazujš strzałki. bieństwo uzyskania poszczególnych wyników przy serii wielu rzutów otrzymuje się podnoszšc dwumian do odpowiedniej potęgi. Można posłużyć się w tym celu trójkštem Pascala (ryc. 98). Wzór ogólny przedstawia się następujšco: m n-m gdzie : n - liczba zdarzeń serii, - prawdopodobieństwo okreœlonego zdarzenia, q - 1 - p = prawdopodobieństwo alternatywnego zdarzenia, m - liczba zdarzeń z wynikiem p, ! - oznacza silnię danej łiczby. Przykład. Zakładajšc populacyjnš częstoœć zespołu Downa 1 : 640, jakie jest prawdopodobieństwo, że rodzina majšca 5 dzieci będzie miała 2 dzieci z tym zespołem na skutek przypadku: p =1/640 q # 639/640 n =5 Tn.=2 (2XlX3X2X1) X640 630 # lOX2,44X10-8X0,997 = 2,43X10#6 Prawdopodobieństwo jest znikome, ok. 2,5 szans na 100000. Toteż należy szukać przyczyny, którš móglby być nieprawidłowy kariotyp jednego (obydwojga) rodziców, wiek matki lub działanie czynników œrodowiska. Można z danych statystycznych obliczyć odpowiednie prawdopodobieństwa. W omawianym przypadku łatwo można sprawdzić empirycznie pierwsz# i drugš możliwoœć. W odniesieniu do czynników œrodowiska pojedyncza rodzina może nasuwać podejrzenia, ale nie może służyć do wykazania zwišzku przyczynowego. Prawdopodobieństwo warunkowe dotyczy prawdopodobieństwa zdarzenia, które jest uzależnione od innego zdarzenia. Inaczej mówišc, zdarzenie A jest warunkowane wystšpieniem zdarzenia B. W praktyce lekar2 często sprawdzg prawdopodobieństwo hipotezy (rozpoznania) posługujšc się prawdopodobień:twem warunkowym. Rozumowanie przedstawia tabela 47. 21# ł a b e 1 a 47. Prawdopodobieństwo wystšpienia i rozpoznania choroby 1. Prawdopodobieństwo wystšpienia (odpowiada częstoœci występowania w populacji) 2. Prawdopodobieństwo wystšpienia objawu C (odpowiada częstoœci objawu w przebiegu choroby, tj. prawdopodobieństwu warunkowemu) 3. Łšczne prawdopodobieństwo wystšpienia objawu C i choroby -4. Prawdopodobieństwo rozpoznania 5. Rozpoznanie choroby A jest bardziej prawdopodobne Choroba A # Choroba B 0,015 0,18 0,37 0,01 0,00555 v,vv#aa # 0,75 0,00555 -#- 0,0018 0,0018 V,VVlV # 0,25 0,00555 -f- 0,0018 Załóżmy, że objaw C występuje w dwóch chorobach A i B. Ze statystyk znana jest względna częstoœć występowania obu tych chorób w populacji. Sš to dane empiryczne, które można wykorzystać do okreœlenia prawdopodobieństwa wystšpienia choroby (punkt 1 tabeli 47). W punkcie 2 zapisujemy prawdopodobieństwa warunkowe uzyskane z częstoœci występowania obja#wu C w przebiegu obu chorób. W punkcie 3 obliczamy prawdopodobieństwo łšczne wystšpienia jednoczeœnie objawu i choroby, mnożšc wartoœci zapisańe w punkcie 1 i 2. Aby porównać względne prawdopodobieństwa zakładamy, że występuje jedna z tych dwóch ehorób, to jest, że rozpoznanie albo A, .albo B wyczerpuje wszystkie możliwoœci i jest zdarzeniem pewnym. W tym celu należy dane znormalizować dzielšc każde z łšcznych prawdopodobieństw przez ich sumę. Podstawę rozumowania stanowi twierdzenie Bayesa oma-wiane w podręcznikach teor prawdopodobieństwa lub statystyki. Rozumowanie można uogólnić. Z danych piœmiennictwa znamy pierwotne prawdopodobieństwo (częstoœć występowania) stanu, który założono w hipo#tezie (np. rozpoznaniu). Poprzez badanie uzyskujemy dane empiryczne (D), których warunkowe prawdopodobieństwo dla każdej rozważanej hipotezy jest :znane. Zapisuje się je P (D # H). Wykorzystujšc szereg takich danych można uzyskać łšczne prawdopodobieństwo, np. współistnienia objawów w chorobie. Dzielšc poszczególne łšczne prawdopodobieństwa przez ich sumę, którš zapisuje się #'P#(DH#), można porównać prawdopodobieństwo każdej z hipotez, np. możliwych rozpoznań. Ten tok rozumowania, przedstawiony w tabeli 48 jest podstawš komputerowych programów diagnostyki różnicowej. Ten sam tok rozumowania służy do analizy rodowodów (patrz rozdział XAnaliza rodowodów). Informacja empiryczna powinna dotyczyć populacji, z której pochodzi badana rodzina. Często informacja taka jest niedostępna. Toteż wszystkie po#radnie genetyczne posługujš się danymi przybliżonymi. Potrzebna jest znajomoœć częstoœci chorób genetycznych, genów w populacji i nowych mutacji. #Istotne znaczenie ma znajomoœć współczynników zdolnoœci reprodukcyjnej 218 ł a b e 1a 48. Badanie prawdopodobieństwa hipotezy z użyciem prawdopodobieństw warunkowych Hipoteża HI . Hn Frawdopodobieństwo pier- P(H1)P(H2). . . P(Hh) wotne #rawdopodobieństwa warun- P (D,# H11 P (D,# H#). . P (D,# Hn) kowe P (DQ # H1) P (Dy # Hg). . P (Dg # H#) p(D##H1) P(Dn#Hs). . P(D##Hn) Prawdopodobieństwo łšczne P (DI Ht) P (D # H#) . . P (D # Hn) Prawdopodobieństwo hipotezy P(DH1) P(D Hzl .. P(DHn) #,pt(DHj) E;P1(DHt) Ÿipi CDH;) oraz selekcji za i przeciw gametorn o okreœlonym genotypie. W przypadku posługiwania się cechami sprzężonymi (znacznikowymi) trzeba znać ich współ-czynniki rekombinacji. Niezbędne sš dane co do genetycznego ryzyka empirycznego, dotyczšcego aberracji chromosomalnych i chorób wielogenowych. Informaeja teoretyczna obejmuje podstawowe prawa dziedziczenia i podstawy teorii prawdopodobieństwa. Znajomoœć ich jest niezbędna do właœciwego wykorzystania empirycznej i szczegółowej informacji. Informacja szczegółowa obejmuje dane o fenotypie poszczególnych członków rodziny. Należy ustalić wzajemne pokrewieństwo probanda i pacjenta. Następnie należy przeprowadzić analizę możliwoœci wnioskowania o geno#ypie tych członków rodziny, których pozycja w rodowodzie pozwala na wnioskowania o genotypie pacjenta. Wstępna analiza rodowodu często poawala tylko na okreœlenie, jakie dodatkowe dane należy zebrać lub jakie badania wykonać. GENOłYP PACJENłA Genotyp pacjenta może być okreœlony z dużym prawdopodobieństwem, graniczšcym z pewnoœciš na podstawie cech fenotypu i/albo danych rodowodu lub badania z użyciem technik rekombinacji DNA. Bardzo często jednak genotyp może być tylko przyjęty z okreœlonym prawdopodobieństwem, naj#zęœciej na podstawie konfrontacji fenotypu z prognozš genetycznš ustalonš dla rodziców pacjenta. Ten tok rozumowania, wykorzystujšcy rachunek prawdopodobieństwa, zostanie przedstawiony łšcznie z prognozš genetycz#š. W odniesieniu do chorób jednogenowych często można ustalić genotyp pacjenta na podstawie jego fenotypu i danych rodowodu (informacji szczegółowej), informacji teoretycznej oraz empirycznej z wystarczajšcš dla celów praktycznych pewnoœciš. Należy kierować się następujšcymi ogólnymi regułami. Osoba, która wykazuje autosomalne cechy dominujšce w fenotypie, ma przynajmniej jeden gen warunkujšcy danš cechę i jest przynajmniej heterozygotš pod względem tego genu. Należy jednak pamiętać o koniecznoœci różnicowania z fenokopiš przy nieobcišżonym rodowodzie i ze stanem homozygotycznoœci przy dwustronnie obcišżonym rodowodzie. Podobne rozumowanie obowišzuje przy analizie pacjenta lub pacjentki, wykazujšcych #echy dominujšce sprzężone z chromosomem X. Można przyjšć, że wszyscy synowie chorego mężczyzny sš zdrowi, a wszystkie córki sš chore. Potom#stwo chorych matek wykazuje cechę w połowie przypadków, niezależnie od pł„. Homozygotycznoœć u kobiet jest mało prawdopodobna, gdyż dominu 219 jšce cechy sprzężone z chromosomem X sš zwykle letalne u homozygot. ## to zresztš nadzwyczaj rzadkie przypadki. Choroba recesywna sprzężona z chromosomem X ujawnia się u mężczyzny. W wielu przypadkach heterozygotycznoœć kobiet daje sie ustalić laboratoryjnie. HomozygotycznoœE kobiet pod względem choroby sprzężonej z chromosomem X jest zdarzeniem rzadkim. Przypadki autosomalnych chorób dominujšcych oraz dominujšcych i r<# cesywnych chorób sprzężonych z chromosomem X sš w większoœci wynikiem œwieżej mutacji. Im mniejsza jest zdolnoœE reprodukcyjna chorej osoby, tym większe jest prawdopodobieństwo, że choroba jest wynikiem nowej mutacji. Krańcowo rzecz bioršc, wszystkie przypadki letalnych (zdolnoœć reprodukcyjna = 0) chorób dominujšcych autosomalnych i sprzężonych z chromosomem X sš wynikiem œwieżej mutacji. Nowe metody lecznicze zmieniajš ten stan rzeczy i osoby obcišżone cechami letalnymi w obecnym stanie wiedzy, mogš przeżywać dłuższe okresy i dochodzić do reprodukcji. Stšd częstoœć genu może zaczšć wzrastać i przekroczyć pierwotnš wartoœć, tj. stan, w którym częstoœE genu w populacji była równa częstoœci mutacji. W przypadku chorób recesywnych sprzężonych z chromosomem X względny udział nowych mutacji w częstoœci genu w populacji zależy od zdolnoœci reprodukcyjnej hemizygot (mężczyzn z cecham: choroby). Różnicowanie pomiędzy chorobš odziedziczonš a będšcš wynikiem œwieżej mutacji ma znaczenie dla ustalenia prognozy genetycznej krewnych chorej osoby. Jeżeli pacjentem jest osoba chora, to przekazuje ona chorobę potomstwu, niezależnie od tego, czy odziedziczyła chorobę, czy ma jš w wyniku œwieżej mutacji rodzicielskich gamet. W przypadku chorób recesywnych autosomalnych należy pamiętaE, że wiele z nich jest w rzeczywistoœci przekazywanych w sposób kodominujšcy. W tej sytuacji (choroby metaboliczne) można w wielu wypadkach wykonaE badania laboratoryjne, które pozwalajš wnioskować o dawce genu u badanej osoby. Można przyjšć, że rodzice dziecka z chorobš przekazywanš wytšcznie tokiem recesywnym sš heterozygotami. Prawdopodobieństwo, że jedno z rodziców jest heterozygotš, a u drugiego wystšpiła œwieża mutacja podczas gametogenezy jest tak małe, że można je pominšć. W przypadku chorób, które mogš dziedziczyć się autosomalnie recesywnie i w inny sposób, rodzice dwojga chorych dzieci sš heterozygotami, a choroba jest recesywna. Różnicowanie w takim przypadku między sprawš autosomalnš a sprzężonš z chromosomem X zależy od posiadanej informacji empirycznej i płci chorych dzieci. W każdym przypadku, w którym możliwe jest wykonanie badań laboratoryjnych potwierdzajšcych rozpoznanie, należy takie badanie wykonać. Nie należy opierać się na obrazie klinicznym i danych z wywiadu, lecz jeżeli można, uzupełnić je badaniami dodatkowymi. Inaczej mówišc, im bardziej szczegółowy jest opis fenotypu, tym pewniejsze jest wnioskowanie o genotypie. Jak już wspomniano, rozpoznanie anomalii chromosomalnej na podstawie obrazu klinicznego, a nie na podstawie oznaczenia kariotypu, jest błędem w sztuce. W niektórych sytuacjach można wykorzystać cechy sprzężone z genem poszukiwanej choroby. Przy stosowaniu tej metody obowišzujš następujšce zasady. Znacznikowa (markerowa) cecha sprzężona oraz poszukiwana cecha chorobowa muszš byE kontrolowane genetycznie przez pojedyncze locus auto#omalne. Oba locż muszš byE œciœle sprzężone ze sobš (patrz rozdział VIIDziedziczenie jednogenowe). Osoba badana musi być potomkiem podwójne# 220 heterozygoty. Należy dysponować pewnš informacjš o pozycji rozważanych loci (cis-, trans-). WskaŸnik rekombinacji rozważanych locf musi być znany. WskaŸnik rekombinacji jest miarš wiarygodnoœci badania. Jeżeli wynosi on np. 0,05, to prawdopodobieństwo, że otrzymano miarodajny wynik wynosi 1-0,5 = 0,95 i jest wystarczajšce. Proponowano również wykorzystanie znaczników sprzężonych dla badania przekazywania zespołów wielogenowych (cechy HLA i wady cewy nerwowej). Sš to metody oparte na danych doœwiadczalnych i ich miarodajnoœć może być tylko z nich okreœlona. Brak teoretycznego wyjaœnienia podważa zaufanie do metody. W podsumowaniu należy stwierdzić, że zanim zostanie udzielona porada genetyczna, należy zanalizować, z jakim prawdopodobieństwem ustalono genotyp pacj enta. OKRE#LENIE PROGNOZY GENEłYCZNEJ Przez pojęcie prognozy genetycznej należy rozumieć przewidywanie wybranych elementów genotypu i fenotypu potomstwa pacjenta. Obejmuje to nie tylko przewidywanie, czy okreœlona choroba wystšpi u potomstwa, ale również przewidywanie przebiegu choroby, nasilenia objawów, czasu przeżycia itp. Cechy potomstwa zależš oczywiœcie od genotypów obydwojga rodziców, toteż prognoza musi opierać się na rozważeniu danych o nich obojgu. Najczęœciej porady zasięgajš mężczyzna i kobieta pragnšcy mieć wspólne dziecko. Niekiedy jednak zdarza się, że o poradę prosi pojedyncza osoba i brak miarodajnych danych o drugim z rodziców. Praktycznie zdarzajš się trzy takie sytuacje: 1) osoba pochodzšca z obcišżonej rodziny zwraca się z pytaniem, czy jej dzieci będš dotknięte; nie ma aktualnych lub planowanych zwišzków z drugš osobš; 2) jedno z aktualnych lub przyszłych rodziców zasięga porady w tajemnicy przed drugim; 3) rodzice dziecka z obciażonej rodziny zapytujš o jego przyszłoœć prokreacyjnš. Nieco podobnš sytuację stanowi zwrócenie się o genetycznš poradę przedmałżeńskš przez osoby majšce nieobcišżone rodowody. Pierwszš zasadš okreœlania prognozy genetycznej jest stwierdzenie, że każda para rndzicielska w danej populacji ponosi populacyjne ryzyko urodzenia dziecka z chorobš genetycznš. Wielkoœć tego ryzyka równa się częstoœci występowania tych chorób w rozważanej populacji (patrz rozdział IZnaczenie genetyki w praktyce lekarskiej). Poszczególne osoby w populacjf mogš ponosić dodatkowe ryzyko ze względu na występujšce u nich niekorzystne geny, które ujawniajš się w fenotypie potomstwa w interakcji z genami przekazanymi przez drugiego z rodziców. Prognoza genetyczna dotyczy tylko rozważanej cechy. Okreœlenie wielkoœci ryzyka genetycznego (prawdopodobieństwa wystšpi#nia rozważanej choroby) nie zmienia wielkoœci ryzyka pnpulacyjnegn i rozważana para rodziców ryzyko to ponosi niezależnie od prognozy okreœlonej dla rozważanej cechy (choroby). Jest to niezwykle istotne, gdyż pacjenci zazwyczaj uważajš korzystnš prognozę genetycznš (rozważana choroba nie wystšpi u potomstwa) za równnznacznš ze stwierdzeniem, że przyszle dziecko będzie zdrowe. Ryzyko populacyjne istnieje zawsze. Ryzyko genetyczne zależy pnnadto od wieku osnby zasię#ajšcej porady. Ryzyko urodzenia dziecka z aberracjš chromosnmalnš wzrasta z wiekiem matki (patrz niżej). Pewne dane wskazujš, że ryzyko wystšpienia mutacji genowych wzrasta z wiekiem 221 ojca. W przec#wieństwie do ryzyka zwišzanego z wiekiem matki ryzyko genetyczne zwišzane z wiekiem ojca jest niewielkie i przynajmniej do 55 roku życia można je pominšć. Ryzyko zwišzane z wiekiem ojca powyżej 55 lat nie jest dokładnie okreœlone iloœcńowo. Wydaje się jednak, że jest ono niewielkie. Drugš, bardzo istotnš zasadš przy okreœlaniu prognozy genetycznej jest więc reguła, że populacyjne ryzyko genetyczne jest różne dla poszczególnych grup wiekowych kobiet i istotnie wzrasta dla kobiet rodzšcych po 37 roku życia. Trzecia zasada mówi o tym, że prognoza genetyczna ustalona dla pojedynczej osoby, a nie dla pary przyszłych rodziców, ma ograniczonš wartoœć. Czwarta zasada stwierdza, że prognoza genetyczna jest zawsze probabilistyczna. Wielkoœć prawdopodobieństwa, z którym okreœlono prognozę genetycznš, zmienia się zależnie od tego, czy genotyp pacjentów jest znany, czy też tylko zakładany z pewnym prawdopodobieństwem. W tym ostatnim przypadku wykorzystuje się dane rodowodu. Inne znaczenie należy przypisywać danym rodowodu dotyczšcym krewnych wstępnych, a inne - dotyczšcym krewnych zstępnych. OKRE#LENIE PROGNOZY GENEłYCZNEJ W CHOROBACH JEDNOGENOWYCH Okreœlenie prognozy genetycznej w chorobach jednogenowych jest oparte na prawach Mendla. Przy znanym genotypie pacjentów jest to w zasadzie sprawa prosta. W wyniku zwišzku dwóch homozygot pod względem tej samej c:echy powstaje homozygota. Zwišzek dwóch różnych homozygot prowadzi do powstawania heterozygoty. Wynik zwišzku dwóch homozygot jest więc jednoznacznie okreœlony z prawdopodobieństwem = 1. Zwišzek heterozygoty z homozygotš może prowadzić do powstania homozygoty lub heterozygoty z równym prawdopodobieństwem, tj. 50o/o. Zwišzek dwóch heterozygot prowadzi do powstania albo jednej z dwóch możliwych homozygot (prawdopodobieństwo po 25#/o), albo heterozygoty (prawdopodobieństwo 50o/o). Stwierdzenia te wynikajš z krzyżówek przedstawionych w rozdziale o dziedziczenic jednogenowym. W odniesieniu do autosomalnych chorób dominujšcych można by więc przewidywać prawdopodobieństwo urodzenia chorego potomstwa na podstawic prawdopodobieństwa powstania homozygoty zmutowanej (tj. z genem choroby lub odpowiedniej heterozygoty. W rzeczywistoœci jednak przewidywanie tc sprawdza się jedynie w odniesieniu do względnie mało upoœledzajšcych cect o pełnej penetracji. W wielu chorobach tej grupy homozygoty ginš we wc'zesnym rozwoju i tylko heterozygoty majš szanse przeżycia przez dłuższy okres W celu opracowania pełnej i miarodajnej prognozy genetycznej nieżbędna jes' więc znajomoœć rozkładu prawdopodobieństw przeżycia okreœlonego czasu współczynnika penetracji, prawdopodobieństwa różnych stopni ekspresji cechy (nasilenia objawów choroby) i współczynnika zdolnoœci reprodukcyjne w danej jednostce chorobowej. W odniesieniu do większoœcń dominujšcycl chorób nie ma liczb, które charakteryzowałyby te wielkoœcń. Dysponuje sit danymi jakoœciowymi, jak np. stwierdzeniem, że dana choroba prowadzi najczęœciej w stanie homozygotycznoœci do œmierci we wczesnym okresie życia Toteż nawet w pozornie prostym układzie prognozy dla dominujšcej chorobJ autosomalnej ustalenie prognozy z matematycznš dokładnoœciš jest w obeců nyrn stanie wiedzy możliwe tylko w niektórych przypadkach. W uproszczeniu można przyjšć, że w przypadku obcišżenia dominujšcš cho 222 robš autosomalnš prawdopodobieństwo urodzenia chorych dzieci wynosi dl„# zwišzku : 1) homozygota typ zmutowany (m/m) )( heterozygota typ zmutowany/tyg# dziki (m/-f-): 1,0 (wszystkie dzieci chore), 2) heterozygoty (m/-#) )( (m/#-): 3/,, czyli 0,75 lub '/s, czyli ok. 0,66, jeżeli homozygoty (m/m) ginš we wczesnym okresie życia (zarodkowym lub płodowym), 3) heterozygoty (m/-f-) z homozygotš (- #/#-): 0,5 (połowa potomstwa jest chora). Oczywiœcie, zwišzek dwóch homozygot, niezależnie, czy (m/m) )( (m/m) czy (m/m) )( (#--/-#), prowadzi do powstania gamet obcišżonych, tj. do bezpłodnoœci, zmniejszonej płodnoœci lub urodzeń chorych dzieci. Posługujšc się danymi z rozdziału o dziedziczeniu jednogenowym, Czytelnik może okreœlić prawdopodobieństwo urodzenia dzieci chorych, nosicieli choroby i zdrowych w zależnoœci od genotypów pacjentów obcišżonych genem choroby autosomalnej recesywnej. Ponownie należy podkreœlić, że teoretyczne przewidywania mogš ulec modyfikacji na skutek selekcji za lub przeciw heterozygo= tom lub homozygotom. ftozważajšc choroby recesywne, należy pamiętaE, że w rzeczywistoœci wiele# z nich dziedziczy się w sposób kodominujšcy. Kilkakrotnie poruszanym przykładem sš choroby metaboliczne, w których można odpowiednim testem wykryć heterozygotę (nosiciela). Inny pouczajšcy przykład stanowi anomalia Pel= gera i Hueta, występujšca u ludzi i królików. Polega ona na hiposegmentaeji jšder granulocytów i na charakterystycznych zmianach struktury jšder innych komórek układu krwiotwórczego. Cechę tę McKusick klasyfikuje jako. dominujšcš. Hodujšc króliki z anomališ Pelgera i Hueta uzyskuje się potomstwo wy#kazujšce cechę i nie wykazujšce jej w stosunku 2 : 1, przy jednoczesnym zmniejszeniu płodnoœci w porównaniu z krzyżówkami rodzeństwa które cechy nie wykazuje (Nachtsheim 1954, własne doœwiadczenia). Sekcjaů ciężarnych zwierzšt wykazuje obecnoœć obumarłych płodów lub resorpcji. W kilku przypadkach udało się wyhodować potomstwo ginšce w pierwszych dniach życia i majšce objawy ciężkiej chondrodystrofii i fokomelii. Opisano też dwa podobne przypadki u ludzi. Dane te œwiadczš o tym, że anomalia# Pelgera i Hueta w obrębie układu krwiotwórczego jest spowodowana pojedynczš dawkš genu, który w podwójnej dawce prowadzi do ciężkich zaburzeń. rozwojowych i zwykle do œmierci w okresie płodowym lub zarodkowym. Ina= czej mówišc, osoba (lub królik) z anomali# Pelgera i HueLa w układzie krwiotwórczym jest heterozygotš w odniesieniu do recesywnej cechy "chondrodystrofia typu Pelgera i Hueta". Przykład ten wskazuje na koniecznoœć dalekoů posuniętej ostrożnoœci przy wnioskowaniu o toku dziedziczenia rzadkich cech. Obserwujšc nieliczne rodziny ludzi z anomališ Pelgera i Hueta, majšce nie-. zbyt liczne potomstwo, łatwo jest przyjšć dominujšcy tok dziedziczenia. W sytuacji, w której genotyp pacjentów nie jest znany, a jest tylko zakładany z pewnym prawdopodobieństwem na podstawie danych rodowodu, na= leży posługiwaE się prawdopodobieństwem złożonym, wykorzystujšc twierdzenie Bayesa. Odpowiednie metody postępowania sš omawiane w podręcznikach poradnictwa genetycznego. W tym rozdziale zostały podane tylko dwa przykłady, pierwszy oparty na obliczaniu prawdopodobieństwa złożonego i drugi wykorzystu;šcy twierdzenie Bayesa (patrz poprzednie ustępy tego rozdziału ů szczegółowo omawiajš te sprawy Murphy i Chase, 19?5. Rycina 99 przedstawia rodowód rodziny z chorobš recesywnš, który może być wykorzystany do zilustrowania okreœlania prognozy genetycznej dla różnych krewnych probanda. 223: Ryc. 99. Rodowód rodziny a chorobš recesywnš. W nawiasach podano prawdopodobieństwo heterozygotycznoœci, nie oznaczono tego prawdopodobieństwa dla II,E i III,1, gdyż odpowiada ono ezęstoœci genu w popuIacji i zależ, od rozpoznania (w zaIożeniu przyjęto chorobę recesywnš, be: sprecyzowania rozpoznania). lll 1V Jest nim dziewczynka III,4 z chorobš recesywnš o pewnym toku dziedziczenia, ustalonym z danych piœmiennictwa, rozpoznanie jest pewne. Stšd rodzice I1,2 i II,3 sš obligatoryjnymi heterozygotami (prawdopodobieństwo P = 1,0). Ich genotypy sš więc znane i ponoszš oni ryzyko dla każdego następnego dziecka = '/a (25#/#), że będzie ono chore. Liczba urodzeń zdrowych lub chorych dzieci nie zmienia wielkoœci tego ryzyka. Kolejne zapłodnienia sš zdarze-niami niezależnymi. Wykorzystujšc podane wyżej rozumowanie o prawdopoůdobieństwie uzyskania poszczególnych wyników rzutu monetš i rozwinięcie dwumianu w trójkšcie Pascala, Czytelnik może przeprowadzić formalny dowód. Udział nowych mutacji w chorobach recesywnych jest znikomy, można więc przyjšć z wystarczajšcš ufnoœciš, że zmutowany gen pochodzi od krewnych wstępnych, tj. pokolenia I. Dla wszystkich czworga dziadków i babek probanda można więc obliczyć jednakowe prawdopodobieństwo heterozygotycznoœci: P # '/z (50o/a dla każdego). Posługujšc się tš informacjš, można obliczyć dla heterozygotycznoœci P # '/z dla osób 1,4 i 5 pokoleniu II. Dla I11,5 prawdopodobieństwo złożone p = 1/e)C'/? = '/#. I11,2 oraz III,3 sš dziećmi dwóch heterozygot i majš fenotyp prawidłowy. Sš więc albo heterozygotami albo homozygotami typ dziki, z prawdopodobieństwem =/a dla heterozygoty i '/, dla homozygoty typ dziki. Dla osoby IV,1 ryzyko heterozygotycznoœci wynosi I X 2 2 3 3 ko posiadania chorych dzieci dla wszystkich tych osób wynika z ryzyka heterozygotycznoœci pomnożonego pr#ez względnš częstoœć genu w populacji (ozna.czonš przez q), pomnożonego przez ryzyko urodzenia homozygoty ze zwišzku dwóch heterozygot, to jest '/#. Stšd: dla II,1; II,4; II,5 ryzyko = '/#X'/,Xq # '/nq dla I11,2 i III,3 ryzyko # =/3X'/4Xq # '/sq dla II1,5 ryzyko # '/aX'/,Xq # '/Isq dla IV,1 ryzyko # I/sX'/aXq # '/#zq Ryzyko populacyjne odpowiada względnej częstoœci ehoroby w populacji to jest q= (rozkład dwumianowy). Dla rzadkich chorób recesywnych q jest małe, stšd wszystkie te osoby majš ryzyko znacznie wyższe niż populacyjne. Wystarczy obliczyć ryzyko np. dla mukowiscydozy, gdzi# q wynosi około 'h" a ryzyko populacyjne około 1 : 2500. Jednakże jest to wcišż ryzyko w granicach małego ryzyka. Ryzyko wzrasta istotnie w przypadku małżeństw spo#krewnionych. Na przykład w pr#ypadku zwišzku II,1 z IV,l ryzyko wynosi: '#,X'#,X'/# ''I# W rozważanym kankretnym przykładzie zwišzek osól> nie spokrewnionych II,1 z II,4 lub III,5 ponosi odpowiednio ryzyko 1/#s lub 1/3z. W odniesieniu do osób, co do których uzyskano informację o prawdopodobieństwie genotypu z danych o krewnych zstępnych, prawd#podobieństwo to nie ulega zmiańie niezależnie od dalszej historii reprodukcyjnej. Tak więc ryzyko posiadania dzieci heterozygot dla par I,1 i I,2 oraz I,3 i I,4 oraz dzieci chorych lub heterozygot dla pary I1,2 i II,3 nie ulega zmianie niezależnie od liczby następnych urodzeń zdrowych dzieci. Gdyby jednej z par w pokoleniu I ur4dziło się chore dzieoko, wówczas prawdopodobieństwo heterozygotycznoœci dla każdego z nich (1/e) zmieniłoby się na prawdopodobieństwo 1,0. iv < ##, Ryc. 100. Rodowód rodziny z cechš recesywnš. III,2 jest albinosem. Prawdopodobieństwo genotypu wydedukosanego z danych o krewnych wstępnych jest bardziej podatne na zmianę w zależnoœci od historii repr4- dukcyjnej. Obliczenie prawdopodobieństw opiera się na twierdzeniu Bayesa i polega na rozważeniu prawdopodobieństw teoretycznych w porównaniu z wynikami k#lejnych cišż. Ilustruje to przykład rodowodu na rycinie 100. Załóżmy, że pacjenci to małżeństwo spokrewnione III,1 i III,2, w którym mężayzna III,2 jest a1binosem (rzadka cecha recesywna). A prżorż u III,1 istnieje ryzyko '/z X 1/z =1/4, że jest heterozygotš. Stšd ryzyko, że dziecko IV,l będzie homozygotš pod względem cechy wynosi 1/s. Jeżeli urodzone dziecko nie wykazuje cechy i ma prawidłowy fenotyp, eliminuje to tę możliwoœć. Stštl nowe prawdapadobieństwo, że I1,2 jest heterozygotš wynosi e/r, a że III,1 jest heterozygotš wynosi '/,. Ryzyko dla następnego dziecka wynosi więc '/2 X 1/, = Ih9. Jeżeli następne dzieeko ma prawi„łowy fenotyp, to prawdopodobieństwo, że II,2 jest heterozygotš zmniejsza się do 6/#s, a III,1 - do I/#,. Stšd ryzyko dla trzeciego dziecka zmniejsza się do 1/z6. Z powyższych przykładów wynika, że w przypadku nie znanego genvtypu pacjentów, zakładanego tylko z pewnym prawdopodobieństwem z danych rodowodu, okreœlenie prognozy genetycznej jest złożone. Prognozę genetycznš powinna więc okreœlać specjalistyczna placówka. Opieranie pragnozy na postulawamych a prżorż genotypach bez uwzględnienia informacji z danych o krewnych zstępnych prowadzi do zawyżenia wielkoœci ryzyka. Dodatkowe trudnoœci może nasuwać oltreœlenie prognozy w przypadku chorób występujšcyeh w póŸniejszym okresie życia. Należy wówczas uwzględnić wiek pacjenta i prawdopodobieństwo ujawnienia się choroby w danym wieku. Na przykład osoba obcišżona 50a/o ryzykiem dominujšcej plšsawicy Huntingtona (jedno z jej rodziców ma tę chflrobę) ponosi w zasadzie ryzyk-o 25o/a posiadania dziecka z tš chorobš. Jeżeli jednak abjawy choroby nie wystšpiły w pewnym wieku, to ryzyko ulega zmniejszeniu proporcjonalnie do odsetka osób z chorobš ujawnionš w tym wieku. #V 40 roku życia 75,/o chorych na plšsawicę 15 - Zarys genetyki 225 Huntingtona ma objawy choroby. Stšd osoba obcišżona ponosi ryzyko, że jest heterozygotš : 1/zii0,25 (1/z)(0,25) -#0,5 = 0,2 a dzieci tej osoby ponoszš ryzyko równe połowie tej wartoœci, to jest l0o/o. Innyxn czynnikiem komplikujšcym prngnozę genetycznš jest niepełna penetracja. Ustalajšc prognozę w przypadku obcišżenia chor„bami sprzężonymi z chromosomem X, należy kierować się zasadami podanymi w podrozdziale o genotypie pacjenta. Ujawnienie się choroby u hemizygoty mężczyzny nie œwiadczy o nosicielstwie matki, jeœli rodowód jest nieobcišżony. W około 70o#u przypadków j#st to wynik nowej mutacji. Stšd ryzyko dla następnego syna (i nosicielstwa córki) wynosi P =1/z X 30o/o =15o#o. Urodzenia następnych zdrowych synów zmniejszajš odpowiednio prawdopodobieństwo, że matka jest nosicielkš i płynšce stšd ryzyko dla następnych synów. Należy stosować rozumowanie podobne jak podane powyżej dla autosomalnych chorób recesywnych. Urodzenie dwóch chorych synów praktycznie akreœla genotyp matki jako nosicielki rhoroby z wystarczajšcš ufnoœciš, aby ryzyko dla następnych synów uważać za P=50o#o. W okreœleniu nosicielstwa córek może być przydatne badanie cech sprzężonych z chromosomem X. PROGNOZA GENEłYCZNA W MAŁEŃSłWACH SPOKREWNIONYCH Prognoza genetyczna w małżeństwach spokrewnionych dotyczy przede wszystkim ryzyka wyœtšpienia autosomalnych cech recesywnyćh u potomstwa. Dla cech dominujšcych prognoza jest niezależna od spokrewnienia (genotypy sš znane). Mężczyzna ńie może być homozygotš pod względem chramosomu X. U kobiet h#xnozygotycznoœć pod względem choroby sprzężonej z chromosomem X może być rózważana podobnie jak efekt spokrewnienia dla cech autosomalnych. Zazwyczaj kobiety homozygoty pod względem choroby sprzężonej z chromosomem X ginš w okresie zarodkowym i stšd w małżeństwach spokrewnionych obcišżonych takš cechš wzrasta ryzyko poronień płodów żeńskich. Rodowód na rycinie 101 przedstawia najc#ęstszy bliski stopień spokrewnienia - zwišzek ciotecznego rodzeństwa (kuzynów I stopnia). Prawdopodobieństwo przekazania tego samego genu (alleli) z pokolenia I do pokolenia IV I,1 I3) (3) I,2 1 2 (2% II,2 (4) (4) II,3 (2} II I I 1 2 3 4 I (1) III,1 I5) l5) III,2 (1) 1 2 ##IV,1 IV 1 F# I st C# s Rye. 101. Rodowód małżeństwa spokrewnionego (objaœnienia w tekœcie) 226 wynosi P :1/# X =/# X 1/e = (I/#)3 # 1/8, przekazanie tego samego genu (alleli) z obu stron - matki i ojca ma P =1/8 X 1/8 =1/64. Ponieważ w każdym lo#us w pokoleniu I występujš cztery allele, łšczne prawdopodobieństwo, że oba allele w okreœlonym loc2ss pokolenia IV odpowiadajš temu samemu genowi (allelowi) pokolenia I wynosi P = 4 X '/s4 =1/#s. Różne pochodzenie alleli ma P =1- '/#s =15/##. Stšd prawdopodobieństwo homozygotycznoœci w pokoleniu IV dla aileli a (Paa) ze względu na wspólne pochodzenie wynosi I/:s q, gdz:e q oznacza ezęstoœć genu w populacji. Prawdopodcibieństwo homozygotycznnœci przy różnym poehodzeniu alleli wynosi 15/,s qŸ. Częstoœć drugiego z alleli A jest p. Jeżeli pamiętamy zasadę rozkładu dwumianowego, i że p-3-q =1, to całkowite prawdopodobieństwo homozygotycznoœci wynosi: Paa =16/s6q# -f-1/tsq = qz -#-1/#e#lq Paa = p# -I-1/3spq Ponieważ częstoœć heterożygot ulega zmniejszeniu równemu wzrostowi ćzęstoœci homożygot : Paa =1 pq - #/3npq Wzrost ryzyka wystšpienia choroby recesywnej w małżeństwie spokrewnionym w stosunku do ryzyka populacyjnego zależy od częstoœci genu w populaeji. Frzy dużej częstoœci ryzyko wzrasta nieznacznie, przy małej wzrasta w dużym stopniu. Wniosek: małżeństwo spokrewnione ponosi ryzyko wystšpienia rzadkiej, nie ujawnionej dotychezas w rodzinie ehoroby recesywnej. Podane wyżej rozumowanie można uogólnić posługujšc się współezynnikiem spokrewnienia (wsobnoœci). Ogólny wzór dla współezynnika F przedsta#via się : F # CI#Q)N gdzie N odpowiada liczbie wspólnych przodków w obu liniach. W omawianym wyżej przyk#adzie liczba wspólnych przodków wynosi 5 w każdej linii (ryc. 101) i F = I/ss. Dla zwišzku II,2 i III,2 F =1/e. Podane wyżej wzory można uogólnić dla dowolnego stopnia pokrewieństwa: Paa = (1- F) qz -i- Fp Paa = (1- F) 2 pq Współezynnik F można stosować do rodowodów obcišżonych chorobš x^ecesywnš. Dla rodowodów nie obcišżonych ryzyko mniejsze niż przy F=lhs można pominšć. Nawet przy F =1/e ryzyko jest małe. OKREŒLENIE PROGNOZY GENEłYCZNEJ DLA PACJENłóW OBCIĽŻl#NYCH ABERftACJt# CHftOMOSOMALNĽ LUB CfIOROBĽ WIELOGENOWĽ Okreœlenie prognozy genetycznej dla pacjentów obc?šżonyeh aberraciš chromosomalnš lub chorobš wielogenowš opiera się w obecnym stańie wiedzy wyłšcznie na danych doœwiadeza!iych. Można je odnaleŸć w piœmiennictwie, przede wszystkim w kompendium pod redakejš Bergsmy (1980). Ryzyko aberracji chromosomalnych przy prawidłowym kariotypie rodziców i nieobcišżonym rodowodzie odpowiada w przybliżeniu częstoœci aberraeji w populacji. Œciœlej, ryzyko to odpowiada częstoœci aberracji w populacji, a mniej rzęstoœci aberracji w rodzinach obcišżonych obecnych w tej populacji. Ryzyko dotyczy przede wszystkim urodzenia dziecka z trisomiš 21 i wynosi ok. 1,5 promila. Ryzyko to wzrasta z wiekiem matki i dla kobiet rodzš 227 cych po 37 roku życia osišga wartoœć bliskš lo;'o. Podobnie urodzenie jednego dzieeka z aberracjš chromosomalnš, niezależnie od jej typu, zwiększa ryzyko urodzenia dziecka z tš samš lub innš aberracjš chromosomalnš do ok. lo/o dla matek poniżej 37 lat. Dla kobiet starszyeh ryzyko pozostaje takie samo jak dla innych kobiet tej grupy wiekowej mimo obcišżenia wywiadu. Nieprawidłowoœci kariotypu rodziców zwiększajš ryzyko w różnym stopniu, zależnie od rodzaju nieprawidłowoœci i płci jej nosiciela. Ryzyko ponoszš przede wszystkim nosiciele translokacji zrównoważonych, a jego wielkoœć jest różna zależnie od typu translokacji. Znaczenie tranœlokacji robertsonowskich chromosomów 13 i 14 jest dyskusyjne, podobnie jak wariantów chromosomów #inwersja 9, warianty 16). Okreœlenie prognozy genetycznej należy w tych przypadkach pozostawić specjalistycznym placówkom. Ryzyko genetyczne w przypadku zespołów wielogenowych również zależy od rodzaju choroby. Można przyjšć bardzo ogólnš regułę, że wystšpienie choroby u jednego z bliskich krewnych pocišga za sobš ryzyko w granicach od 3 do 5o/o. Wystšpienie zespołu u dwóch członków rodziny zwiększa ryzyko do 10-15o/o. ftyzyko empiryczne ponownego wystšpienia choroby wielo#enowej jest różne w odmiennych populacjach. POI#ADA GENEłYCZNA Porada genetyczna polega na przekazaniu informacji o ustaleniach, tj. o rozpoznaniu, podłażu genetycznym choroby u probanda, taku dziedziczenia i prognozie genetycznej dla pacjentów. Omawiajšc prognozę należy pamiętać o stopniu obcišżeńia, które powoduje choroba oraz o przedyskutowaniu możliwoœci leczenia lub rehabilitacji. Następnie należy wskazać możliwe opeje z uwzględnieniem diagnostyki prenatalnej, sztucznego unasiennienia i możliwoœci adopcji. Nie ma sztywnych reguł udzielania porady genetycznej. Sposób przekazania informacji zależy od wykształcenia pacjenta, jego osobowoœci i sytuacji życiowej oraz od osobowoœci lekarza. Porady można udzielać zespołowo lub pojedynezo, w cišgu jednej lub kilku wizyt itp. Można podać kilka bardzo ogólnych wytycznych. Większoœć pacjentów nie zna praw dziedziczenia. Należy je więc wyjaœnić w przystępny sposób. Większoœć też nie zna pojęć rachunku prawdopodobieństwa. Trzeba wyjaœnić probabilistyczny charakter prognozy genetycznej. Liczbowe okreœlenie wielkoœci ryzyka genetycznego nie przemawia do wyobraŸni. Umownie przyjęto za Carterem okreœlać ryzyko do 5o;i" jako małe, w granicach 5 do l0o/o jako œrednie, a powyżej IOo/o jako duże. Pacjentowi należy podać wielkoœć ryzyka dokładnie, a następnie okreœlić je jako małe, œrednie lub du#że i porównać z ryzykiem codziennego życia, jak np. ryzykiem wypadku drogowego, wypadku przy pracy w zawodzie pacjenta lub ryzykiem zachorowa#nia na często występujšce choroby. Oczywiœcie, do oceny ryzyka dochodzi #cena obcišżenia, jakie choroba powoduje. Pacjent powinien zrozumieć treœć porady i w dyskusji z lekarzem radzšcym podjšć samodzielnš decyzję. Lekarz nie powinien narzucać swoich poglšdów. Ńie jest to łatwe, tym bardziej, że często pacjenci oczekujš wskazania najlepszego wyjœcia i zadajš pytanie, jakš decyzję podjęłaby osoba, udzielajšca porady. Decyzja prokreacyjna jest sprawš tak osobistš, że lekarz nie może pod;šć jej za pacjenta. Omawiajšc diagnostykę prenatalnš, należy wielkoœć ryzyka genetycznego porównać z ryzykiem proponowanej metody badania. Amniocenteza genetycz #28 na powoduje ryzyko dla plodu mniejsze niż lo#o, natomiast w obecnym stanie techniki amnioskopia powoduje ok. IO#io ryzyka straty płodu. Obie metody majš znikome ryzyko dla matki. Zakońezenie cišży ze wskazań genetycznych; wykonane zgodnie z zasadami, przy użyciu prostaglandyn lub mikrocięciem cesarskim, powoduje ryzyko równe ryzyku porodu. Z punktu widzenia możliwoœci powikłań i skutków dla następnych cišż ryzyko przerwania cišży przez wyłyżeczkowanie w pierwszych 12 tygodniach jest znacznie wyższe. Po przedyskutowaniu porady z pacjentem należy odpowiednio przystępnie sformulowanš jej treœć przekazać mu na piœmie, gdyż z biegiem czasu pacjenei zniekształcajš ustnš treœć porady. Wskazane jest przekazanie kopii lekarzowi kierujšcemu. Z doœwiadezeń autorów tego rozdziału wynika, że porada genetyczna powinna być udzielana przez specjalistów w tej dziedzinie. Lekarze innych specjalnoœci powinni ograniczyć się do stwierdzenia genetycznego obcišżenia i potrzeby porady oraz właœeiwego skierowania pacjenta. Plaeówka genetyczna powinna zapewnić właœciwš opiekę pacjentowi i jego rodzinie, kierujšc do odpowiednich specjalistów. Bardzo istotnš sprawš jest utrzymanie dalszego kontaktu i uzyskanie informacji o dalszych losach rodziny, której udzielono porady. Konfrontujšc treœć porady i aktualne decyzje pacjentów z celem poradnictwa, którym jest umoż= liwienie genetyczńie obcišżonym rodzinom posiadania zdrowych dzieci, lekarz udzielajšcy porady może dokonać kontroli skutecznoœci swego działania. PO ZlSUMO WANIE Podstawowym celem poradnictwa genetycznego jest umożliwienie genetycznie obeišżonym rodzinom posiadania zdrowych dzieći poprzez wskazanie rodzinom ryzyka możliwoœci wezesnego wykrycia chorych członków rodziny i zapewnienie im wezesnego właœciwego leczenia lub rehabilitacji. Następnym celem poradnictwa jest zmniejszenie częstoœci urodzeń chorych genetycznie. Poradnictwo opiera się na identyfikacji rodzin i osób ryzyka genetycznego oraz przekazaniu im informacji o wielkoœci tego ryzyka. Naœtępnym etapem jest wskazanie możliwych opeji ;prokreacyjnych, możliwoœci leczenia i rehabilitacji oraz organizacja opieki genetycznej. Cały personel służby zdrowia, niezale#nie od specjalnoœci, powinien brać udzial w identyfikacji rodzin i osób ryzyka. #.V. Diagnost##a prenatalna Lucja# Wżœrzżezuskż Nat#ralnš #onsekwencjš i przedłużeniem poradnictwa genetycznego jest d„agnostyka prenatalna chorób uwarunkowanych genetycznie. Poradnictwo genetyczne operuje pojęciem ryzyka opartym na prawdopodobieństwie statystyeznym. Diagnostyka prenatalna natomiast poz-t#ala na rozpoznawanie wielu ciężkich schorzeń plodu we względnie wczesnym okresie cišży, kiedy można zastosować postępowanie lecznicze - lub podjšć decyzję o przerwaniu cišży, gdy nie ma żadnych możliwoœci terapii. Na szybki rozwój diagnostyki prenatalnej w ostatnim dziesięcioleciu złożyło się wiele czynników. Jednym z nich bylo niewštpliwie wprowadzenie do diagnostyki prenatalnej badań ultrasonograficznych. Badania takie umożliwialy rozpoznawanie wielu wad oœrodkowego ukladu nerwowego (o.u.n.) już od 12 tygodnia cišży, pozwalaly na okreœlenie odpowiedniego terminu pobrania wód płodowych oraz zwiększały bezpieczeństwo zabiegu amniopunkcji. Poza waclami o.u.n. zastosowanie odpowiednich aparatów ultrasonograficznych umożliwia rozpoznawanie również takich nieprawidłowoœci, jak malogłowie, wady serca, nerek, układu kostnego itp. Poczštkowo diagnostyka prenatalna, przeprowadzana w II trymestrze c:šży, opierala się głównie na badaniach ultrasonograficznych oraz zabiegu amniopunkcji. Ten ostatni polegal na pobraniu próbek płynu o##iodńiowego. Komórki z płynu hodowano i po ok. 2-3 tygodniach można bvło uzyskać wy Ry#. 102. Ultrasonogram płodu w 17 tygodniu ci#ży. Brak prawidłowych ech odgłó#=?#i płodu. 230 niki badań cytogenetyeznych lub biochemicznych. W samym płynie owodniowym prowadzi się głównie badania stężenia alfa-fetoproteiny i acetylocholinoesterazy - znaczników (markerów) wad oœrodkowego układu nerwowego. Istotnym elementem, wpływajšcym na rozwój diagnostyki prenatalnej, bylo wprowadzenie w latach siedemdziesištych pršżkowych metod identyfikacji chromosomów, pozwalajšcych na rozpoznawanie aberracji chromosomo#vych, zarówno liczbowych, jak i strukturalnych. ### latach ostatnich opracowano metody pobierania kosmków trofoblastu, pozwalajšce na wykonywanie diagnostyki prenatalnej już w I trymestrze cišży, szczególnie w przypadkach zwišzanych z diagnostykš chorób chr4mosomowych. OCENA KAIZIOłYPU PŁODU Możliwoœć wykrycia wad chromosomowyeh u,płodu w klasyenej już diagnostyee prenatalnej II trymestru cišży jest uzależniona od sposobu hodowli komórek wód płodowych, jak też odpowiedniego doboru metod pršżkowych do identyfikacji chromosomów. 231 Ryc. 104. Płód po rozpoznaniu prenatalnym przepukliny móz- gowo- rdzeniowej potwierdzo- nej po indukowanym poronie- niu. Ryc. 103. Płód z rozpoznanš prenatalnie wadš bezmózgowia po wywołaniu poronienia za po- moeš prostaglanclyn. Pobranie wód płodowych dfl analizy chromosomów, jak i do innych badań. odbywa się między 16 - 18 tygodniem cišży. W wodach płodowych znajdujš się komórki pochodzšce z owodni, naskórka płodu, nabłonka przewodu pokarmowego, układu oddeehowego oraz moczowo-płciowego. Większoœć komórek jest uszkodzona, jedynie kilka z nich, od 3 do 5 w 1 ml, wykazuje zdolnoœć wzrostu. Materiał do hodowli powinien być pobrany w warunkach jałowych, zakładany do hodowli w specjalnych laminarach z nawiewem jałowego powietrza. Założone ho.dowle prowadzi się w inkubatorach z przepływem 5#! " COz, utrzymujšcych odpowiedniš temperaturę i wilgotnoœć. Dzięki zastosowaniu niezbędnych odczynników i pożywek, których opis przekraczałby ram y tego rozdziału, pobrane komórki dajš się z powodzeniem hodować in vitro. Metody hodowli komórek z wód płodowych opisało wielu autorów, m.in. Nadler (1969 r.), Santesson (1969 r.), Bn”rr - Gardner i wsp. (1972 r.), Paul (1975 r.), Sehmidt (1975 r.), z polskich autorów - Snieżek (1969 r.). Wyróżniamy dwie formy wzrostu komórek z wód płodowych, a mianowicie fibroblastopodobne i nabłonkowopodobne. Dla badań cytogenetycznych nie ma większego znaczenia, jaki jest rodzaj badanych komórek. Garnitur chromosomowy jest stałš cechš każdej komórki. Jednak istniejš czynniki wpływajšce niekiedy na zachowanie się chromosomów podczas hodowli i doprowadzajšce do powstawania kilku linii komórkowych różnišcych się kariotypem (mozaikowoœć). Dlatego niektórzy badacze bazujš na hodowlach wyprowadzonych z jednej komórki - metoda hodowli i#. situ i stosujš doœć skomplikowany nieraz system kontrolny. Bardzo interesujšcš modyfikacjš met#dy uzyskiwania chromosomów z hodowli komórek wód płodowych jest pobieranie kilku komórek dzielšcych się z hodowli 3-4-dniowej (Claussen, 1983 r.) i wykonanie preparatów chromosomowych do wstępnej, szybkiej analizy. Rutynowo stosowana hodowla wód płodowych wymaga 2 - 3 tygodni wzrostu, w celu uzyskania dostatecznej liczby dzielšcych się komórek. Jak dotšd, nie wykryto czynnika pobudzajšcego wzrost komórek fibroblastopodobnych, tak jak to jest w przypadku limfocytów, gdzie pod wpływem fitohemaglutyniny następuje przyspieszenie podziałów komórkowych x już po 48 h można okreœlać kariotyp. Ważnym czynnikiem w diagnostyce prenatalnej zaburzeń cllromosomalnych jest postęp w zakresie identyfikacji chromosomów. Grupa badaczy pod kierownictwem Casperssona opublikowała pierwsze obserwacje dotyczšce zróżnicowanego wišzania się barwników fluoryzujšcych z hetero-euchromatynš chromosomów. Zauważono, że chromosomy wišżš barwniki nierównomiernie, ale według stałego powtarzalnego wzoru. Metoda fluorescencji umożliwiła opracowanie nowych kryteriów klasyfikacji chromosomów homologicznych, dokładniejsze rozpoznanie aberracji strukturalnych chromosomów i wiarygodn# ocenę kariotypu. Dalsze opracowania wykazały zróżnicowanie poprzeczne chromosomów #>rzy zastosowaniu barwnika Giemsy po uprzednim traktowaniu preparatów trv,nsynš lub solankami. Obserw#wano też ciemne barwišce się barwnikiem Giemsy rejony okołocentromerowe (bloki C) przede wszystkim chromosomów 1, 9, 16, Y i chromosomów akrocentrycznych oraz mniej wydatne - w pozostałych chromasomach. Poprzeezny wzór pršżkowy ealych chromosomów (pršżki G), widocmy po barwieniu barwnikiem Giemsy, stał się przydatny w diagnostvce prenatalnej. Odwrotnoœciš morfolo#icznš pršżków G sš pršżki R. Akt,#salnie żstnieje wiele metod pršżkowych i opracowano ich specjalnš nomenkiaturę. Najszerzej stosowanš metodš pršżków G jest metoda GłG, pršżków C - CBG, pršżków R - metoda RBA. Wskazania do oznaczania kariotypu płodu przedstawiajš się następujšco: 232 1. Wiek matki powyżej 35 roku życia. 2. Wiek ojca powyżej 35 roku życia (dyœkusyjne). 3. Trisomia 21 u dziecka z poprzedniej cišży. 4. ftodzinnie występujšcy zespół áowna. 5. Inne aneuploidie niezależne od trisomii 21 (trisomia 13, 18, 8) z poprzedniej cišży. 6. Mozaikowatoœć chromosomowa w kariotypie rodzicielskim (np. z lini# z dodatkowym chromosomem 21). 7. Nosicielstwo translokacji zrównoważonej u rodziców (translokacja wymienna lub heterologiczna fuzja centryczna). e. Nosicielstwo innych aberracji chromosomowyeh. 9. Zwiększone ryzyko wystšpienia schorzenia sprzężonego z płciš. 10. Zwiększone ryzyko urodzenia dziecka z zespołem łamliwego chromosomu X. I1. Zwiększone ryzyko wystšpienia zespołu nadnerczowo-płeiowego u płodu# 12. Zwiększone ryzyko schorzeń genowych z niestabilnoœciš chromosomowš (z. Blooma, z. Fanconiego, xeroderma pig%n,e#tosum, atnxża teleangiectasia): Rodzinne występowanie zespołv Downa wišże się często z układem mozadkowym w kariotypie rodziców lub z translflkacyjnš formš tego zespołu. Urodzenie dziecka z zespołem Downa z formš translokacyjnš de novo nie wišżesię ze zwiększonym ryzykiem urodzenia następmego dziecka z tym zespołem. Należy jednak mieć gwarancję co do xzeczywistego ojc#stwa dziecka z tš zmianš. W przypadku, gdy translokacyjna forma zespołu Downa jest wynikiem zrównoważonej translokaćji u jednego z rodziców, ryzyko powtórzeni# zależy od tego, czy translokacja jest pochodzenia ojcowskiego, czy też matczynego (większe ryzyko, gdy nosicielem jest matka) oraz od tego, które z chromosomów uczestniczš w translokacji. W przypadku translokacji homologicznej# t(21;21) każde następne dziecko z tego zwišzku będzie obarczone zespolenx Downa i to l00a/o ryzyko powtórzenia zespołu Downa pow#duje, że odstępuje się od diagnostyki prenatalnej w razie kolejnej cišży. Można zaproponnwać metodę inseminacji heterologićznej, gdy nosicielem tej aberracji jest ojciec, zanim małżonkowie zdecydujš się na następnš cišżę. Nosicielstwo translo'kacji typu t(13;21), t(14;21), t(15;21), t(21;23) jest wskazaniem do diagnostyki prenatalnej, przy czym najczęœciej spotykanš aberracjš translokaeyjnš u donoszonych noworodków z zespołem Downa jest t(14;21). Wielkoœć ryzyka urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem u nosi~ cieli translokacji zrównoważonych jest funkcjš prawdopodobieństwa tworze= nia się gamet niezrównoważonych pod względem zawartoœci materiału genetycznego a prawdopodobieństwem przeżycia płodów z niezrównoważonym kariotypem. Wiadomo, że wiele nieprawidłowo ukształtowanych płodów, w tym, z zespołem Downa, ulega biologicznej selekcji przez poronienia samoistne. VV przypadku translokacji wymiennych zrównoważonych istnieje możliwoœćů powstawania niezrównoważonych kariotypów u płodów i ryzyko urodzenia dziecka z wadami zależy od zawartoœci genetycznej niezrównoważonego segmentu chromosomu, niezależnie od wielkoœci tego segmentu. Stwierdzenie# aberraeji strukturalnej u płodu w wyniku diagnostyki,prenatalnej wymagabardzo wnikliwej oceny, czy aberracja jest zrównoważ#na, czy nie. Czasami trzeba korzystać z bardzo pracochłonnych technik cytogenetycznych o dużej rozdzielczoœci, aby zinterpretować zmianę i jej konsekwencje fenotypowe. Do niedawna w rodzinach o zwiększonym ryz#ku wystšpiemia chorób sprzężonych z plciš ocena kariotypu płodu ograniczała się jedynie do ustalenia 233# płci. Aktualnie diagnostyka prenatalna tych sehorzeń została wzbagacona -o inne badania, bardziej charakterystyczne dla tych jednostek, opierajšce się na bezpoœredniej anali#ie DNA (sondy genetyczne). ZASłOSOWANIE BIOPSJI Ti#OFOBLASłU W DIAGNOSłYCE PIœ.ENAłALNEJ Często stosowany zabieg amniopunkeji, pomimo nieżbyt dużego ryzyka powikłań (1o/o), ma pewne ograniczenia. W ra#ie lokalizacji łożyska w przedniej œcianie macicy wykonanie zabiegu amniopunkeji zdeeydowanie zwiększa ryzyko poronienia. Najistotniejszym jednak problemem jest zabieg przerwania cišży w razie rozpożnania wady u płodu, co przypadałoby na okres 20 - 24 tyg. Z tego względu najbardziej korzystnym okresem diagnostyki prenatalnej jest I trymestr cišży, a tkankš dostępnš do badań - trofoblast. W tym czasie tkanka łożyskowa znajduje się w stadium kosmówki. W dobrze wykształco,nych kosmkach trzeciorzędowych znajdujš się naczynia krwionoœne pokrywajšce całe jajo płodowe. Kosmówka nie zawiera tkanek matezynych. Materiał do badań prenatalnych można uzyskać, dokonujšc biopsji przez kanał szyjki macicy, pobierajšc kosmki #arówno z kosmówki krzewiastej, tzn. z miejsca implantacji, jak i z kosmówki gładkiej. Należy wzišć pod uwagę, że po 10 tygodniu cišży kosmki kosmówki gładkiej zanikajš, w kosmówće krzewiastej zaczyna rozwijać się płyta podstawowa, a nadto miejsce implantacji może być ulokowane daleko od ujœcia wewnętrznego. Zmiany te utrudniajš otrzymanie kosmków do badań i większoœć autorów uważa, że badanie powinno wykonywać się przed ukońezonym 10 tygodniem cišży. Pierwsze doniesienie o biopsji trofoblastu (Bł, chorion villi sampling = #VS) zostało przedstawione przez Hahnemanna i Mohra w 1958 r., dotyczyło 8 kobiet we wezesnej cišży, które tuż przed planowanym jej przerwaniem ze wskazań społecznych zgodziły się na ten dadatkowy zabieg. Użyto endoskopu o œrednicy 6 mm, który wprowadzono przez kanał szyjki do jamy maeicy, a następnie kleszezykami biopsyjnymi póbierano próbkę tkanki o wymiarach 1,5 X 0,5 X 0,2 em. Tylko jedna próbka (badana w mikroskopie œwietlnym) była pochodzenia płodowego. Rok póŸniej ci sami autorzy opiœali 63 biopsje w I trymestrze cišży. Technika była taka sama, a wyniki lepsze: w 20a/o uzyskano materiał pochodzenia płodowego, gdzie oznaczono kariotyp. U 12 pacjentek cišżę przerwano po 8 dniach - żadna z nich wezeœniej nie poroniła. Jedynym, acz obcišżajšcym powikłaniem, było znalezienie w 12o/0 materiału komórek owadni. Metoda biopsji trofoblastu była już od kilknastu lat stosowana w Chinach, lecz dopiero w 1995 r. opublikowano wyniki biopsji u 100 kobiet w I trymestrze cišży. Użyto sztywnej kaniuli metalowej o œrednicy 3 mm, któr# wprowadzano na œl#po 6 - 9 cm poza ujœcie zewnętrzne szyjki maćicy i następnie aspirowano, po odezuciu lekkiego oporu stawianego przez najbliższy fragment kosmówki. Gdy nie uzyœkiwano materiału, procedurę powtarzano, #vkładajšc kaniulę w nieco innym kierunku. Paejentki w czasie 30 min po zabiegu szły do domu. Najbardziej k#mpleksowo potraktowali biopsję trofo'blastu badac#e z Mediolanu - Simoni, Brambati i wsp. (1983, 1984 r.), #tórzy przedstawili zarówno techniki biopsji, jak i możliwoœci różnorakich badań otrzymanego materiału. Przedstawiono wyniki badań eksperymentalnych oraz badań diagnostycznych na dużym materiale (ponad 100 pacjentek). Rozkład wskazań dc biopsji diagnostycznej przedstawiał się następujšco: 87o/o - występowanic '234 #nomalii chromosomowych, l0o#o - wystšpienie chorób sprzężonych z chromosomem X oraz 3o/o z powodu wystšpienia chorób metabolicznych. Ultrasonograficzna lokalizacja trofoblastu, ocena stanu płodu (akcja serca, ruchy) przed i po badaniu oraz dokładna kontrola położenia cewnika w ezasie biopsji czyniš ten właœnie sposób pobierania kosmków do badania najlepszym i najbezpieczniejszym dla pł#du. Próbki płodowe uzyskano w 96o/o przypadków. Po zabiegu obserwowano kilkudniowe plamienie. Poronienie samoistne wystšpiło w 2o/o przypadków diagnostycznych. Nie stwierdzono zakażenia jaja płodowego (infekcji wewnštrzmacicznej). Dżięki szybkiemu rozwojowi techniki pobierania kosmków, przed diagnostykš prenatalnš w I trymestrze cišży pojawiajš się coraz większe możliwoœ#i. Pobrane podczas biopsji kosmki zawierajš, oczywiœcie, taki sam materiał genetyczny i enzymatyczny jak płód, a we wczesnej cišży masa ich nie przekracza 50o/o całego pęcherzyka płodowego. Do wykonania badań wystarcza już ok. 5 mg tkanki, a iloœć optymalna to 10 - 30 mg. Kariotyp płodu oznacza się z komórek trofoblastu metodš bezpoœredniš bez uprzedniego hodowania kosmków żn vżtro. Metoda ta umożliwia okreœlenie kariotypu plodu już po kilku gndzinach po biopsji. Brambati i Simoni #v 1983 r. zdiagnozowali trisomig 21 pary chromosomów (zespół Downa) w 11 tygodniu cišży po upływie 5 h od pobrania kosmków. Najczęœciej,jednak stosuje się tżw. "overnight technique" i ocenę materiału po 24 h. Dżięki temu możliwe jest zdiagnozowanie we wczesnej oišży chorób uzależnionych od liczbowych aberracji chromosomalnych (zespół Downa, zespół Edwardsa itd.) nraz zespół #'urnera, Klinefeltera itp. Badania genetyczne można też wykonać po 24 h od biopsji, jakkolwiek œtosuje się często metodę poœredniš, tzn. hodowlę Ÿ#. vżtro kosmków w celu otrzyman;a szybko rosnšcych kultur komórkowych. Możliwoœć dokładnej identyfikacji i oceny chromosomów metodš pršżków pozwala na diagnozowanie ehorób uza?eżnionych od strukturalnych aberracji chromosomalnych, np. zespół Cri-du-chat (zesp. "miauczenia kota"). Hodowla komórek trofoblaœtu stwarzała jednak kilka poważnych problemów. Pierwszy - to małe tempo wzrostu komórek trofoblastu w zwykłych waruńkach hodowlanych. Problem rozwišzano, hodujšc kosmki na specjalnych pożywkach Changa wzbogaconych hormonami, co znacznie przyspieszyło tempo wzrastania komórek. Drugi problem - to pojawianie się domieszki komórek matczynych w badanym materiale. Poczštkowo w pobranym materiale dominowały kariotypy #6,XX. Wišzało się to z niedoskonałymi technikami biopsji oraz brakiem doœwiadczenia w identyfikacji komórek doczesnej. Dokladne przeglšdanie materiału pod inwertoskopem pozwala na eliminację zanieczyszczenia badanych próbek komórkami matczynymi. Dzięki temu można mieć pewnoœć, że ujrzana właœnie mitoza i otrzymany z niej kariotyp 46,#;X jest kariotypem płodu, a nie matki. Większoœć aut#rów jest zdania, że metody bezpoœrednie badania kosmków majš przewagę nad metodami poœrednimi (hodowlš). Spontanicznie powstajšce mitozy w kamórkach kosmków, pochodzšcych z trofoblastu, pozwalajš na uzyskiwanie kariotypów i preparatów chromosomowych dabrej jakoœci, czas badania jest zredukowany do 2 dni, a koszty znacznie zmniejszone. Badanie enzymatyczne wykonuje się metodš iloœciowš oraz elektroforezy, także bez koniecznoœci hodowania kosmków. Poczštkowo zakres tych badań był bardzo wšski, póŸniej stopniowo zaczęto oznaczać więcej enzymówszczególnie lizosomalnych. Simoni i Brambati oznaczajš 7 enzymów lizosomalnych, a Gustavii - 11, co nie oznacza, oczywiœcie, kresu możliwoœci diagnozy odpowiednieh bloków metabolicznych. Badanie enzymów lizosomal 235 nych ma tu istotne znaczenie, pondeważ wœród ok. 50 rozpoznawalnych w czasie cišży błędów metabolicznych znacznš częœć stanowiš enzymopatie lizoœomalne. Dotychczas dzięki biopsji w I trymestrze cišży udało się zdiagnozować takie choroby, jak mukopolisacharydozy I - VI, glikogenozy i inne. Reasumujšc, w porównaniu z metodami diagnostyki prenatalnej stosowanymi w II trymestrze cišży, biopsja trofablastu ma kilka istotnych zalet: Przede wszystkim w razie niekorzystnego wyniku badania poronienie sztuczne w I trymestrze cišży jest zdecyd-owanie bardziej bezpieczne, szybsze i mn„ej obcišżajšce matkę. Ta nowa metoda nie wyprze całkowicie amniopunkcji, na razie bowiem nie można tak wczeœnie zdiagnozować np. otwartych wad układu nerwowego u płodu. Przeglšd piœmienn#ctwa wykazuje, że biopsja trofobiastu jest badaniem. stosunkowo bezpiecznym i coraz częœciej stosowanš metodš przez wiele oœrodków prowadzšcych diagnostykę prenatalnš. O ile do 1983 r. wykonano ok. 165 biopsji diagnostycznych, to obecnie liczba ich przekroczyła już 1000# w 89 oœrodkach. Na tak dużym materiale akreœl4no ryzyko biopsji na około 3,6o/o. Jest to tzw. fetal loss rate (FLR). Różni się on nieznaeznie w zależnoœci od oœrodka - wg Simoniego wynosi 4 - go#o, dane chińskie podajš 2 - 3o/or a amerykańskie 3 - 4o/o. Poronienie po biopsji może byE spowodowane przebiciem pęcherza płodowego lub drażnišcym działaniem wprowadzonego do macicy ciała obceg#. Inne obserwowane powikłania to zakażenia (na szczęœcie, występujšce rzadko) i kilkudńiowe plamienia u znacznej częœci pacjentek, ale nie kończšce się poronieniem ćišży. Wydaje się słuszne, by w celu zmniejszenia częstoœci FLR przestrzegać ogólnych zasad, tzn. nie wykonywać biopsji w stanie zapalnym szyjki lub pochwy i plamieniu przed zabiegiem. Jeœli weŸmie się pod uwagę, że ok. 8o/o wszystkich cišż wymaga diagnostyki prenatalnej, ryzyko urodzenia płodu z wadš u kobiet powyżej 35 roku życia wynosi ponad 5o/o, a ryzyko samaistnego poronienia ok. 6,2a!o, to podany wyżej współczynnik FLR jest rzeczywiœcie ńiewielki. Należy przypuszczać, że wraz z rozwojem nowych technik procent powikłań będzie się zmniejszał. Postępy w uzyœkiwaniu czys#tego materiału i eoraz większe możliwoœci ba= dania go powodujš, że biopsja trofablastu prawdopodobnie stanie się najszerzej stosowanym badaniem w diagnostyce prenatalnej. ROLA ULłIZASONOGRAFII W DIAGNOSłYCE Pi#ENAłALNEJ WAD OŒRODKOWEGO UKŁADU NEHWOWEGO Ultrasonografia (USG) jest jednš z metod uwi#oczniania płodu. Badanie ultrasonografdczne ma w diagnostyee przedurodzeniowej potrójne zastosowanie: Metoda ta służy do dokładnego ustalez#ia zaawansowania cišży, lokalizacji łożyska i płodu, a także stosowana jest jako badanie diagnostyczne. Ze względu na niskš częstotliwoœć stosowanych ultradŸwięków (ok. 2 MHz) i krótkie czasy ekspozycji pacjentki powszechnie uważa się, że ultrasonografia jest całkowicie nieszkodliwa dIa pacjentki i płodu. Wiek cišży ustala się na podstawie okreœlenia wymiaru dwu„emieniowego główki płodu, wymiaru poprzecznego klatki i tułow„a, a także pomiaru koœci długich kończyn płodv. Ultrasonografia jako metoda diagnostyczna w zakresie wad wrodzonych najwczeœn„ej była stosowana w wykrywaniu otwartych wad cewy nerwowej. Wady oœrodkowego układu nerwowego sš najbardziej licznš, równolegle do aberracji chromosomalnych, grupš schorzeń genetycznie uwarunkowanych. 236 Ryzyko ich wystšpienia jest różne dla okreœlonych regianów geograficznych. Œrednie ryzyko wystšpienia tych wad dla całej Wielkiej Brytanii wynosi 4,5#'#o; nato#xniast dla Szkocji sięga ono aż 9#oo. Szacuje się, że w Polsce łšczna częstoœć wyœtępowania bezmózgowia i rozszezepu kręgosłupa wynosi 1,15o/oo. Oznacza to, że w kraju rodzi się roeznie ok. 690 dzieei z ciężkimi wadami oœrodkowego układu nerwowego na 600 000 żywo urodzanych. Ryzyko powtórnego wystšpienia bezmózgowia i rozszez#pu kręgosłupa w rod#inie dużego ryzyka jeœt znacznie większe. Odpowiednie dane przedstawione sš w t„beli 49. Jako pełny miarodajny test rozpoznania wad oœrodkowego układu nerwowego przyjmuje się badania ultrasonograficzne oraz oznaczenia stężenia alfa-fetoproteiny i acetylocholinoesterazy w płynie owodniowym. Dodatkowym testem wskazujšcym na istnienie wady oœrodkowego układu nerwowego jest zjawisko przyspieszonego przyklejania się komórek płynu owodniowego do podłoża w czasie ich hodowli. ł a b e 1 a 49. Ryzyko wystšpienia otwartej wady oœrodkowego układu nerwowego z## rodzinie dużego ryzyka (wg Smitha) Wywiad Je„r:o dziecko z wadš .ledno z rodziców obcišżone wadš Jedno z radziców obcišżone wadš oraz jedno dziecko obcišżone wadš 13 D##-oje dzieci z wadš 13 Troje dzieci z wadš 13 Jedno dziecko i krewny z trzeciej linii z wadš g ,ledro dziecko i krewny z trzeciej linii z wadš 7 w % Ba#daniem USG można wykluczyć lub rozpoznać, jak już wspomniano, wiele wad zwišzanych z zaburzeniami anatomicznymi płodu. Najezęœciej wykrywane sš wodogłowie i bezezaszkowie. W tych przypadkach badanie należy rozpoczšć od dokładnej analizy struktur wewnštrzezaszkowych, wyglšdu i pomiarów główki. W analizie struktur wewnštrzezaszkowych należy brać pod uwagę: echo œrodkowe (echo od sierpu mózgv, echa od komory III i wodocišgu mózgu - Sylwiusza). Następnie bardzo ważne w obserwacji sš echa od komór bocznych mózgu, które powinny być zlokalizowane symetrycznie w obydwu półkulach, istotne również sš echa rogów czołowych i potylicznych, splotu naczyniowego itp. Obraz USG w bezezaszkowiu jest eharakterystyczny - brak echa od koœci pokrywy czaszki, zwykle obecne sš echa od koœci potylicznych i oczodołów. Rozpoznanie wodogłowiia opiera się głównie na analizie lokalizacji echa komór bocznych i oblicza#iu wskaŸnika komorowo-główkowego (wartoœć prawidłowa wskaŸnika komorowo-główkowego wynosi 0,5) oraz na pomiarach główki. Jest to niezmiernie ważne; gdy wymiar dwuciemieniowy główki odpowiada zaawansowaniu cišży - wówezas rozpoznajemy tzw. wodogłor<#ie wewnętrzne. Małogłowie można rozpoznać za pomocš ultrasonografii, prowadzšc analizę cotygodniowych pomiarów główki płodu (wymiar dwuciemieniowy). Zatrzymanie ###zrostu na pewnym etapie może œwiadezyć o wystšpieniu tej wady. Przepuklinę oponowo-mózgowš można rozpoznać jako charakteryœtyczne echo (;,worek wypełniony płynem lub tkankš mózgowš"), wychodzšce z koœci pokrywy czaszki w częœci potylicznej lub czołowej. Rozszezep kręgosłupa w obrazie USG rozpoznaje się na podstawie wyglšdu kręgosłupa (normalnie kręgosłup w przekroju podłużnym ma wyglšd dwu linii cišgłych równoległych, a w przekroju poprzecznym - litery O). 237 Przy rozszczepie kręgosłupa w przekroju podłużnym w danym miejscu następuje załamanie linii i przerwanie cišgłoœci na okreœlonym odcinku. Często może być uwidoczniona przepuklina oponowo-rdzeniowa jako dodatkowe półkoliste echo nad miejscem uszkodzenia. Natomiast w przekroju poprzećznym w miejscu rozszczepu kręgosłup ma charakterystyczny wyglšd litery "V" lub "U". Badaniem USG można również rozpoznać inne anamalie koœćca płodu, jak np.: brak lub skrócenie koœci kończyn (na padstawie liczby palców, pomiaru długoœci poszczególnych koœci kończyn), niedorozw„j poszczególnych grup kostnych, a nawet z„burzenia w uwapnieniu koœćca. W obrębie narzšdów 'klatki piersiowej za pomocš USG sš rozpoznawane torbiele lub przepukliny przeponowe. Obecne ultrasonografy pozwalajš na rozpoznanie wad serca płodu, wad przewodu pokarmowego i innych. Doœć częste sš an-omalie wy#ikajšce z braku cišgłoœci przedniej œciany brzucha (przepuklina pępkowa i pępowinowa, wytrzewienie jelit). Osobnš grupę stanowiš zaburzenia układu moczowo-płciowego. Za pomocš USG można stwierdzić: niedorozwój nerek, wodanercze jedno- lub dwustronne, którym często towarzyszy wodobrzusze, torbielowatoœć nerek itd. Z anomalii narzšdów płciowych możliwe jest rozpoznanie wodniaków jšder. Unowoczeœnienie aparatury ultrasonograficznej pozwoliło na rozwój i stosowanie chirurgii płodu w takich przypadkach, jak wodonercze czy wodogłowie. ALFA-FEłÓ#PROłEINA W DIAGNOSłYCE OłWARłYCH WAD OŒRODKOWEGO UKŁADU NERWOWEGO Istotnš rolę w rozwoju diagnostyki prenatalnej odegrało wykrycie przez Brocka w 1972 r. zwiększen;ia zawartoœci alfa-fetoproteimy w wodach płůodowych i surowicy ciężarnej w przypadku bezmózgowia. Obserwacja ta została potwierdzona doniesieniami innych autorów. Zwiększenie zawartoœci tego białka zaobserwowano również w rozszczepie kręgosłupa z przepuklinš mózgowo=rdzeniowš, zaroœnięciu przełyku, cišży mnogiej, nerczycy wrodzonej. Alfa-fetoproteina (AFP) wytwarzana jest przez pęcherzyk żółtkowy płodu, a następnie przez komórki mišższu wštroby. Występowanie tego białka w tkankach i w surowicy płodu oraz w płynie owodniowym i surowicy ciężarnej jest stanem fizjologicznie prawidłowym. W surowicy krwi nieciężarnych kobiet białko to występuje w stężeniu mniejszym niż 5 wg/ml i wykrywalne jest jedynie za pomocš technik radioimmunologicznych. W czasie cišży białko to przenika przez barierę łożyskowš z krwiobiegu płodu do krwiobiegu matki i występuje w stosunkowo dużych iloœciach w płynie owodniowym. Stężenie AFP w surowicy krwi płodu osišga maksymalnš wartoœć 3 - 5 mg/ml ok. 14 tygodnia cišży. W wodach płodowych maksymalna zawartoœć tego białka wynosi 30 #g/ml (między 13 i 14 tygodniem cišży). W surowicy ciężarnej białko to staje się wykrywalne w ósmym tygodniu cišży, a maksymalne stężc'mie 200 ng/ml osišga w 32 tygodniu cišży. Występowanie zwiększonego stężenia AFP w surowicy ciężarnej i płynie owodniowym jest znamiennie skorelowane z występowaniem wad oœrodkowego układu nerwowego u płodu, dlatego też oznaczanie AFP w płynie owodniowym i surowicy aiężarnej jest właœciwym testem w diagnostyce prenata1nej tych wad. Oznaczanie AFP w surowicy jest traktowane jako badanie przesiewowe, natomiast okreœlenie stężenia AFP w płynie owodniowym jest jednym z głównych badań, na podstawie którego ustala się diagnozę. Ryc. 105. Dynamika zmian stężenia a-fetoproteiny (AFP) w wybranych płynach ustrojowych w przebieg# cišży prawid#owej (wg Sepp„la). W praktyce zdarzajš się wypadki wyników fałszywie pozytywnych i fałszywie negatywnyeh, dlatego też przy interpretacji uzyskanych wyników zawartoœci AFP należy uwzględnić naœtępujšce problemy: 1. Zanieczyszczenie płynu owodniowego krwiš płodowš - stężenie AFP w krwi płodowej jeœt 150 - 300 razy większe niż w płynie #wodniowym. 2. Prawidłowe okreœlenie wieku cišży - normy opracowane sš dla poszczególnych tygodni cišży. 3. Możliwoœć wystšpienia innych zmian patologicznych płodu, które wpływajš na zwiękœzenie stężenia AFP. Bioršc pod uwagę powyższe zastrzeżenia, mależy posługiwać się równolegle innš metodš biochemicznš, jakš jest okreœlenie stężenia specyficznej acetylocholinoesterazy i profilu elektroforetycznego jej izoenzymów. AKłYWNOSĆ ACEłYLOCHOLINOE#łERAZY W PŁ#NIE OWODNIOWYM W WADACH OSIćODI#OWEGO UKŁADU NERWOWEGO Bardzo przydatnš metodš pozwalajšcš wykryć wady o.u.n. jest metoda oparta na pomiarze aktywnoœci acetylocholinoesterazy (AChE) w płynie owodniowym. W Centrum Zdrowia Dziećka opracowano normy dla tego enzymu w tych tygodniach cišży, w których przeprowadza się diagnostykę prenatalnš (tab. 50). Aktywnoœć acetylocholinoesterazy oznacza się wstępnie metodš Ellmana. Aktywnoœć AChE jest niezależna od wieku cišży ani od ewen 289 'ł a b e I a 50. Wartoœci stężenia esterazy eholinowej (AChE) i a- fetoproteiny (AFP) #w głyůnie owodniowym dla poszczególnych t.ygodni cišży (dane opracowane w Cen- #rum Zdrow ia Dziecka) tualnego zanieczyszczenia krw#š płodowš w czasie pobierania płynu owod:niowego, pańieważ stężenie AChE we krwi pępowinowej jest małe. Jeœli stężenia AFP lub AChE sš zwiększone, należy wykonać elektroforezę na żelu poliakrylam#dowym izoenzymów AChE z płynu owodniowego. Pozwala ona na identyfikację tworzšcego się w patologicznym przebiegu cišży pršżka specyficznej acetylocholinoesterazy, ujawniajšcego się w elektroforezie. Rozdział elektroforetyczny można przeprowadzić niezależnie od pre#yzyjnego okreœlenia wieku aišży, a także od zanieczyszczeń płynu owodniowego krwiš płodowš. Badanie to wydaje się być najbardziej wiarygodnym testem w razie podejrzenia o wystšpienie wady oœrodkowego układu nerwowego. Ryc. 106. Profile izoenzymów acetylocholinoesterazy AChE w żelu poliakrylamidowym: 1 - pršżki odpowiadajšce cišżom obcišżonym otwartš wadš OUN u płodu (dwa pasma aktywnoœci), 2 - pršżek charakterystyczny dla cišż prawidłowych (jedno pasmo aktywnoœci). 240 DIAGNOSłYKA BLOKÓW MEłABOLICZNYCH I SCHORZEl# T UWARUNKOWANYCH GENEłYCZNIE Bloki metaboliczne sš chorobami genetycznymi częœciej powodowanymi przez zmianę genu niż jego brak. Czasami zmiana dotyczy pojedynczego nukleotydu. Zmieniona informacja g#'tetyczna powoduje powstanże białka z brakiem lub zmniejszeniem aktywnoœci enzymatycznej. Zaburzenia meta15oliczne należš do schorzeń ciężkich, których leczenie jest najczęœciej mało skuteczne, stšd w przypadkach podejrzanych o schorzenie metaboliczne wskazana jest diagnostyka prenatalna. Ze względu na znacznš liczbę jednostek chorobowych, z których każda wymaga adrębnej procedury diagnostycznej, nie prflwadzi się badań przesiewowych na szerokš skalę. Zaleca się prowadzenie badań prenatalnych w kierunku okreœlonych jednostek chorobowych u kobiet, które urodziły poprzednie dziecko obcišżone wadš metabolienš lub w razie wystšpienia wad w rodzinie pacjentki. a b e 1 a 51. Genetycznie uwarunkowane schorzenia metaboliczne, które sš di#nozowane za pomocš biopsji trofoblastu Jednostka chorobawa #. #v#eaoAor aezaminazy adenozynowej 2. Arginino-bursztynuria 3. Cytrulinemia 4. Chondtod7)splasża punctata 5. Zespół nadnerczowo-płciowy 6. Cystynoza 7. Choroba Fabry'ego 8. Zespół Fanconiego - typ I 9. Galaktozemia 10. Choroba Gauchera 11. Acyduria glutarowa - typ I 12. Glikogenoza II (choroba Pompego) 13. Glikogenoza III 14. Gangliozydaza GMI 15. Gangliozydaza GM2 typ I - Taya i Sachsa typ II - Sandhoffa 16. Hipofosfatazja 17. Choroba Krebsa 18. Zespół Lescha i Nyhana 19. a-Mannozydaza 20. á-Mannozydaza 21. Choroba syropu klonowego 22. Zespół Menkesa 23. Leukodystrofia metachromatyczna 24. Acydemia metylomalonowa 25. Mukolipidoza I 26. Mukolipidoza II 2?. Mukopolisacharydoza I (zespół Hurler) 28. Mukopolisacharydoza II (zespół Huntera) 29. Mukopolisacharydoza III (zespół Sanfilippo) 30. Mukopolisacharydoza VI (zespół Moroteaux-Lamy) 31. Mul#opolisacharydoza VII 32. Kompleksowy niedobór sulfatazy 33. Choroba Niemanna i Picka 34. Acydemia propionowa 35. Choroba Refsuma 36. Tyrozynemia - typ I 3?. Choroba Wolmana 38. Zespół Zellwegera 16 - Zarys genetyki 241 Diagnostykę prenatalnš można wykonywać, badajšc komórkd hodowane i# vitro pochodzšce z płynu owodniowego lub stosujšc materiał nie wymagajšcy hodowli, jakim jest trofoblast. Do tej pory diagnostyka prenatalna wykonywana była głównie w II trymestrze cišży. Ze względu na póŸny okres uzyskiwania wyników diagnozy (ok. 20 - 22 tydzień cišży), obecnie w#rowadza się badania diagnostyczne na materiale nie hodowanym, pobranym pomiędzy 8 a 11 tygodniem cišży. Dzięki wprowadzeniu badań diagnostycznych w I trymestrze cišży, wynik badania uzyskiwany jest znacznie wczeœniej - ok. 12 tygodnia cišży i korzystniejsze sš warunki rozwišzywania cišży obcišżonej wadš metabolicznš (tab. 51). Badania diagnostyczne wykonywane sš technikami biochemicznymi, polegajšcymi na pomiarach aktywnoœci enzymatycznych w hodowanych komórkach z wód płodowych albo w komórkach trofablastu lub z zastosowaniem najnowszych technik inżynierri genetycznej. Konwencjonalne metody biochemiczne nie zawsze sš w stanie dać stuprocentowš diagnozę. Powodowane to jest tym, że niektóre enzymy występujš w iloœciach œladowych. Rozwój technik inżyniezńi genetycznej umożliwia dokładnš diagnozę wielu jednostek chorobowych, których liczba stale wzrasta. Metody inżynierii genetycznej opierajš się na badaniu DNA. Do analizy wystarczy 10 wg kwasu dezoksyrybonukleinowego, który można wydzielić już z 10 - 20 mg tkanki trofoblastu. Badanie DNA chromosomowego umożliwia wykrycie: a. Mutacji punktowej - np. niedokrwistoœć sierpowatokrwinkowa wywoływana jest przez mutację punktowš w genie #-globiny, która to spowodowała wymianę kwasu glutaminowego na walinę w pozycji 6 od końca N-terminalnego. Mutacja punktowa, która jest przyczynš tej choroby, usuwa także miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjnš, co powoduje powstanie fragmentów DNA o innej długoœci niż w przypadku osóh zdrowych lub nosicieli. W ten sposób przy zastosowaniu specjalistycznych technik inżynierii genetycznej można ustalić rozpoznanie tej jednostki chorobowej. b. Delecji - np. w a- tałassexnii choroba manifestuje się zmniejszonš syntezš a-globiny, co jest spowodowane najczęœciej delecjš jednego lub więce# genów a- globiny. W warunkach fizjologicznych występujš cztery geny dla a- globiny i sš zlokalizowane na krótkich ramionach chromosomu 16. Diagnostyka prenatalna możliwa jest na podstawie analizy DNA z zastosowaniem metod inżynierii genetycznej (RFLP - restriction fragment length polymorphism, polimorfizm długoœci fragmentów restrykcyjnych). c. Najczęœciej stosowana metoda wykrywania zaburzeń genetycznych polega na wspomnianym wyżej badaniu polimorfizmu (zmiennoœci) fragmentów restrykcyjnych sprzężonyeh ze zmutowanym genem. Różnice w sekwencjach niekodujšcych DNA sš powszechne w genomie ludzkim. Nie dajš one żadnych zmian w fenotypie organizmu, ale wpływajš na długoœć fragmentów DNA powstajšcyeh po cięciu enzymami restrykcyjnymi. Ta nieszkodliwa zmiennoœć genetyczna powoduje polimorfizm długoœci fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Zastosowanie badania polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych DNA w diagnostyce chorób jednogenowych może miee miejsce nie tylko w wypadku chorób, gdzie gen i rodzaj mutacji (jak w niedokrwistoœci sierpowatokrwinkowej) sš znane, ale również tam, gdzie gen jest znany, tzn. sklonowany, ale rodzaj defektu nie jest znany. Hemofilia B. Diagnostykę prenatalnš można przeprowadzić przez korelację w danej rodzinie niefunkcjonalnego genu z polimorfizmem długoœci fragmentów restrykcyjnych. Również sprzężenie polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych z uszkodzonym genem może być wykorzystane w diagnostyce. 242 Schorzenia występujšce w blokach metabolicznych można podzielić na zwiš- zane z przemianš: 1) lipidów, 2) wgglowodanów, 3) aminokwasów, 4) muko- polisacharydów. ZABURZENIA PRZEMIANY LIPIDbW Schorzenia te sš zwišzane z zaburzeniami oœrodkowego układu nerwowego. Do najwczeœniej poznanych chorób należy gangliozydoza GM2, zwana chorobš Taya i Sachsa. Przyczynš powstania tego bloku jest całkowity brak enzymu á-heksozaminidazy A, co powoduje gromadzenie się w komórkach nerwowych gangliozydów. Innš wczeœnie znanš i rozpoznawanš prenatalnie chorobš jest leukodystrofia metachromatyczna. W schorzeniu tym następuje nagromadzenie się sulfatydów siarczanu cerebrozydu w oœrodkowym i obwodowym układzie nerwowym, a przyczynš tego jest brak aktywnoœci arylosulfatazy A. W chorobie Niemanna i Picka następuje odkładanie w różnych narzšdach sfingomielin z powodu braku aktywnoœci enzymu sfingomielinazy, która w warunkach prawidłowych uczestniczy w katabolizmie sfingomieliny. Stężenie tego enzymu obecnie może być okreœlane prenatalnie. W chorobie Gauchera następuje odkładanie w komórkach układu siateczkowo-œródbłonkowego i układu nerwowego glukocerebrozydów z powodu braku aktywnoœci enzymatycznej glukocerebrozydazy (á-D-glukozydazy). W komórkach z wód płodowych można oznaczyć stężenie cerebrozydazy. ZAHURZENIA PRZEMIANY W#GL'flWODANbW Węglowodany stanowiš w naszej diecie jeden z głównych składników służšcych zaspokojeniu potrzeb energetycznych organizmu. Dla plodu jest to prawie jedyne Ÿródło energii, toteż zaburzenia tych szlaków metabolicznych wywołujš daleko idšce zmiany. Jednym z bloków metabolizmu węglowodanów jest galaktozemia. Jest to wrodzona, uwarunkowana genetycznie autosomalna i recesywna wada, polegajšca na nieprawidlowej przemianie galaktozy. W przemianie galaktozy wyróżnia się dwa bloki metaboliczne, zwišzane z brakiem aktywnoœci dwóch enzymów : a) urydylilotransferazy heksozo-1-fosforanowej, b) galaktokinazy. Galaktozemia często, chociaż nie zawsze, prowadzi u dziecka do objawów klinicznych z upoœledzeniem umysłowym włšcznie. Diagnostyka prenatalna tego schorzenia umożliwia urodzenie normalnego dziecka dzięki zastosowaniu przez matkę odpowiedniej diety. W oznaczaniu aktywnoœci urydylilotransferazy i galaktokinazy stosowane sš metody izotopowe, które sš niezwykle czułe i wymagajš małej iloœci materiału. Pomimo stosowania metody izotopowej w oznaczaniu omawianych aktywnoœci urydylilotransferazy i galaktolcinazy występujš bardzo duże rozrzuty w wynikach, tak że okreœlenie œredniej aktywnoœci w przypadku heterozygoty jest doœć trudne. O wystšpieniu galaktozemii może œwiadczyć brak aktywnoœci urydylilotransferazy galaktozo-1-fosforanowej lub galaktokinazy. Objawy kliniczne galaktozemii: marskoœć wštroby, zaćma, opóŸnienie rozwoju umysłowego. Inny blok metaboliczny, zwany chorobš glikogenowš, zwišzany jest z nieprawidłowoœciš przemiany glikogenu, który gromadzi się w wštrobie, nerkach i mięœniu sercowym. Pod względem klinicznym glikogenozy dzielš się 243 na 7 typów, zależnie od bloków w różnych punktach szlaku przemiany glikogenu. Choroba Pompego uwarunkowana jest przez autosomalny gen recesywny odpowiedzialny za syntezę kwaœnej maltazy, czyli alfa-1,4-glukozydazy. Brak tego enzymu powoduje nagromadzenie się glikogenu, co nadaje komórkom mięœni piankowaty wyglšd. Choroba Pompego może być diagnozowana prenatalnie w komórkach z wód płodowych. Choroba Forbesa i Coriego, inaczej glikogenoza typu III, jest schorzeniem uwarunkowanym genetycznie, zwišzanym z niedoborem enzymu amylo-1,6-glukozydazy, który w warunkach prawidłowych odpowiedzialny jest za hydrolizę wišzania 1,6-glukozydowego. W razie braku tego enzymu dochodzi do gromadzenia się glikogenu o nieprawidłowej strukturze. ZABURZENIA PRZEMIANY AMINOKW#S66V Aminokwasy odgrywajš niezmiernie istotnš rolę w metabolizmie organizmu. Sš one podstawowymi jednostkami budulcowymi białek, barwników, hormonów. Homoeystynuria - choroba dziedziczona autosomalnie recesywnie. Trzy defekty enzymatyczne mogš prowadzić do homocystynurii: 1. Syntazy cystationinowej (typ I). 2. Metylotransferazy N5-metylohydrofoliowej (typ I1). 3. Reduktazy N-metylo-tetrahydrofoliowej (typ III). W przypadku zaburzenia zwanego cystynozš nieznana jest przyczyna gromadzenia się cystyny w lizosomie komórek siateczkowo- œródbłonkowych, w rogówce oka, wštrobie, nerce. Zaburzenie to może być diagnozowane prenatalnie w komórkach fibroblastów. Hodowlę fibroblastów prowadzi się w obe#noœci znakowanej cystyny e5S i po kilkudniowej inkubacji można dokonać #omiarów stężeń cystyny znakowanej 85S w hodowanych komórkach metodš autoradiografii. Acyduria metylomalonowa jest chorobš uwarunkowanš genetycznie, autosomalnie i recesywnie, zwišzanš z niedoborem enzymu metylomalonylomutazy. W warunkach prawidłowych enzym mutaza S- metylomalonylo-CoA przekształca L-metylomalonylo-CoA w bursztynylo- CoA. Morrow i inni w 1969 r. wykazali, że piętno "C-propionianu w hodowlach fibroblastów chorego człowieka gromadzi się w metylomalonianie, co potwierdza miejsce tego bloku. Dobrze poznanym blokiem metabolicznym rozpoznawanym prenatalnie jest rhoroba syropu klonowego (ketoacyduria). Jej częstotliwoœć występowania wynosi 1:250 000 żywo urodzonych dzieci w przypadku homozy#ot i 1:250 w przypadku heterozygot. Przyczynš choroby jest brak enzymu dekarboksylazy leucyny odpowiedzialnego za dekarboksylację aminokwasów rozgałęzionych (walina, leucyna, izoleucyna). Komórki chorych tkanek nie metabolizujš aminokwasów rozgałęzionych. Wendel i wsp. opracowali diagnostykę prenatalnš tlla ketoacydurii. Polega ona na inkubacji komórek hodowanych ze znakowanym ketokwasem. Cytrulinemia - choroba wynikajšca z braku aktywnoœci syntetazy arginino#ursztynianu. Można brak tej aktywnoœci stwierdzić w hodowlach fibroblastów skóry. #ABURZENIA PRZEMIANY MUKOPOLISACI-IARYDbW Mukopolisacharydozy należš do wrodzonych wad metabolicznych dziedziczonych w sposób recesywny, autosomalny lub sprzężony z płciš. Objawem kli 244 nicznym jest gromadzenie w lizosomach mukopolisacharydów, które w prawidłowych przemianach ulegajš degradacji przy udziale enzymów lizosomalnych. Klasyfikacja tej grupy sehorzeń oparta jest na rodzaju wydzielanych z moczem mukopolisacharydów, objawach klinicznych (niedorozwój umysłowy, zmiany szkieletowe, zmętnienie rogówki) i rodzaju uszkodzonego białka enzymatycznego. Obecnie znanych jest 7 głównych grup mukopolisacharydoz. Mukopolisacharydy (glikozaminoglikany) sš to zwišzki wielkoczšsteczkowe, długołańeuchowe, zbudowane z dwuczłonowych podjednostek heksozaminy i kwasu uronowego. W warunkaeh fizjologicznych zwišzki te sš degradowane w œciœle ustalonej kolejnoœci. Brak kolejnego enzymu w łańcuchu degradacji powoduje niemożliwoœć dalszego rozkładu zwišzku, który odkładany jest w lizosomach. Diagnostyka prenatalna możliwa jest dzięki badaniom stężenia enzymów zarówno w hodowanych komórkach płynu owodniowego, jak i w komórkach trofoblastu. Zespół Hurler (MPS I H) - choroba dziedziczona autosomalnie i recesywnie. Gzęstoœć występowania tej jednostki szacuje się na 1 - 2 na ok. 100 000 żywo urodzonych. Przyczynš tej choroby jest brak aktywnoœci enzymu a-L-iduronidazy, która może zostać oznaczona za pomocš metod spektrofotometrycznych. Zespół Huntera (MPS II) - sehorzenie dziedziczone jako recesywne i sprzę#one z płciš. Gzęstoœć występowania 1:100 000 żywo urodzonych. Przyezynš choroby jest brak lub zmniejszenie aktywnoœei sulfatazy siarezanu iduronianu. Aktywnoœć tę można okreœlać za pomocš technik izotopowych. Zespół Sanfilippo (MPS III) - dziedziczony w sposób autosomalny, recesywny. Częstoœć występowania szacuje się na 1:24 000 urodzeń. Kliniczne objawy polegajš na niedorozwoju umysłowym przy niewielkich zmianach fizycznych. Zespół ten nie jest jednorodny - opisano 4 typy (A, B, C, D}. W typie A występuje defekt enzymu sulfatazy siarezanu heparanu i wydalany jest siarezan heparanu. Diagnostyka prenatalna możliwa jest przy zastosowaniu metod izotopowych. W typie B - brak aktywnoœci N-acetylo-a-D- glukozaminidazy. Aktywnoœć enzymatycznš można oznaczać metodš spektrofotometrycznš. W typie C brak aktywnoœci acetylotransferazy glukozaminowej. Substanejš spichrzanš i wydalanš w nadmiarze jest również siarezan heparanu. W typie Sanfilippo D defekt dotyczy N- acetylo-a-D-glukozamido-6-sulfatazy. Produkt spichrzania i wydzielania jak w poprzednich rodzajach. Zespół Morquio (MPS IV) - dziedziezony w sposób autosomalny, recesywny, występuje doœć rzadko. Pacjenci dotknięci tš chorobš charakteryzujš się normalnš inteligenejš przy znacznej karłowatoœci. Przyczynš ehoroby jest brak lub zmniejszenie aktywnoœci sulfatazy N-acetylo-heksozamino-6- siarezanu, co można okreœlić za pomocš technik izotopowych. Zespół Seheiego (MPS I S) - dziedziczony w sposób autosomalny, recesywny. Osoby dotknięte tš chorobš charakteryzujš się niewielkimi zaburzeniami wzrostu przy normalnym rozwoju umysłowym. Oceniana jest aktywnoœć a-L-iduronidazy. Zespól Moroteaux-Lamy (MPS VI) - choroba dziedziczona w sposób autosomalny i recesywny, a możliwoœć diagnostyki prenatalnej oparta jest na oznaezaniu stężenia sulfatazy N-acetylogalaktozamino-4-siarezanu. Aktywnoœć tego enzymu jest identyczna z aktywnoœciš arylosulfatazy B. Zespół MPS VII - dziedziczony w speosób autosomalny, recesywny. Jednostka manifestuje się brakiem aktywnoœci á-glukuronidazy, który w fizjo 245 logicznych warunkach hydrolizuje á-glukuronowš podjednostkę. Aktywnoœć zmutowanego enzymu może być badana metodami fluorescencyjnymi lub spektrofotometryeznymi. Gen dla enzymu á- glukuronidazy został zlokalizo- wany na 7 chromosomie. SCHORZENIA SPRZ#ŻONE Z CIiROMOSOMEM X Oddzielnš grupę sehorzeń stanowiš w diagnostyce prenatalnej choroby sprzężone z chromosomem X. Ich nosi#ielkami sš kobiety. W potomstwie kobiety nosicielki 50o/o synów jest chorych, 50o/o córek to także nosicielki jak matki. Do chorób tych należš między innymi: hemofilia A i B, niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, choroba Leseha i Nyhana, moczówka prosta przysadkowa i nerkowa. Podobnie jak cechy w przekazywaniu autosomalnym, cechy determinowane przez geny zlokalizowane w chromosomie X mogš być nie tylko recesywne, ale również - chociaż rzadziej - dominujšce. W przeciwieństwie do reeesywnego dziedziczenia sprzężonego z plciš geny dominujšce sprzężone z płciš wywołujš zmiany chorobowe zarówno u mężezyzn, jak i u kobiet, z tym że u kobiet dwukrotnie częœciej niż u mężezyzn. Skutki przekazywania eeeh sprzężonych dominujšcych warunkowanych genami zlokalizowanymi w chromosomie X przedstawiajš się następujšco: 1. Wszyscy synowie chorego ojca sš zdrowi, wszystkie córki chore. 2. U dzieoi matki heterozygoty sehorzenie występuje w stosunku 1 :1 niezależnie od płci dzieci, jeœli ojciec jest zdrowy. 3. Jeœli chorzy sš ojciec i matka, to wszystkie córki sš obcišżone chorobš, natomiast ryzyko wystšpienia sehorzenia u synów wynosi 1 :1. 4. Wszystkie dzieci homozygotycznej chorej matki sš obeišżone. Diagnostyka prenatalna sehorzeń sprzężonych z chromosomem X była przez dłuższy czas, do czasu wprowadzenia diagnostyki molekularnej, połowiczna i polegała na oznaczaniu płci płodu. Stwierdzajšc płeć żeńskš wykluczano w ten sposób choroby. Stwierdzenie płci męskiej prowadziło często do rezygnacji z cišży, bo wišzało się z przewidywaniem 50o/o prawdopodobieństwa choroby. Równolegle do tego usiłowano pobierać do badania krew z pępow vny lub naczyń łożyska płodu, głównie za pomocš fetoskopii. Od kilku lat diagnostyka prenatalna oparta jest na genetyce molekularnej, a głównie na wykorzystaniu zjawiska polimorfizmu długoœci fragmentów restrykcyjnych DNA. Jako przykład diagnostyki prenatalnej chorób sprzężonych z chromosomem X może służyć postępowanie we wspomnianej już poprzednio hemofilii B. Choroba spowodowana jest brakiem czynnika IX, białka uczestniczšcego w procesie krzepnięcia krwi. Odpowiadajšcy jej gen jest zlokalizowany w chromosomie X, ale nie wyjaœniono jeszeze natury mutaeji w genie uszkodzonym. Diagnostykę prenatalnš można przeprowadzić przez korelację niefunkejonalnego genu z polimorfizmem długoœci fragmentów restrykcyjnych. Defektywny gen wykrywa się przez zwišzek z obecnoœciš specyfricznych miejsc restrykeji różnišcych się od tych od naturalnego genu. Podobnie wykrywa się upoœledzenie umysłowe sprzężone z chromosomem X, chociaż gen odpowiedzialny nie jest znany. W diagnostyce prenatalnej zastosowano polimorfizm długoœci fragmentów restrykcyjnych DNA wykryty przez sondy zlokalizowane w pobliżu tego miejsca. Za pomoeš podobn#;ch metod możliwa jest diagnostyka prenatalna dystrofii mieœniowej typzi Duchenne'a, której locus leży w krótkim ramieniu chrom#somu X. Stwierdzono polimorfizm zwišzany z locus choroby. 246 SCHOftZENIA O NIE USłALONEJ EłIOLOGII Mukowiscydoza (fżbrosżs cżst%ca CF - zwyrodnienie torbielowate) - jest genetycznie uwarunkowanš ehorobš o nie ustalonej dotychczas etiologii. Jest to jedna z najczęœciej spotykanych chorób metabolieznych rasy białej. Częstoœć występowania szacowana jest 1:2500 żywo urodzonych. Cechš charakterystycznš tej choroby jest dysfunkcja gruczołów zewnštrzwydzielniczych, co prow# dzi do uszkodzenia płuc, trzustki, niektórych narzšdów jamy brzusznej, jak również gurczołów potowych. Mukowiscydoza objawia się w różnych postaeiach i nieznany jest czynnik lub czynniki odpowiedzialne za zmiany chorobowe. Przez dłuższy #as diag,nostykę prenatalnš mvkowiscydozy przeprowadzano oceniajšc aktywnoœć enzymów rzęskowych 'y-glutaznylotranspeptydazy (GGłP) i fosfatazy alkalicznej (AF). Metody te nie dawały mnżliwoœci uzyskania pełnej diagnozy. Obecnie znany jest już gen, którego defekt odpowiedzialny jest za powstanie mukowiscydozy. Zlokalizowany jest w długich ramionach chromosomu 7. Poznane zostały sekwencje nukleotydów sšsiadujšce z tym genem i za pomocš znacznika polimorficznego dokonano molekularnej analizy genu mukowiscydozy. FEłOSKOPIA Fetoskopia jest stosunkowo nowym badaniem, w czasie którego w II trymestrze cišży płód m#że być w prosty sposób uwidoczniony i za pomocš którego mogš być póbrane do badań krew i różne tkanki płod4we. W ostatnim czasie badanie to przechodzi z fazy eksperymentalnej i przekształca się w jednš z głównych i stosunkowo bezpiecznych forxn badań w diagnostyce prenatalnej. Stosowane jest głównie do stwierdzenia małych zewnętrznych wad anatomicznych, których nie udaje się wykryć technikš USG, oraz do pobierania krwi i tkanek płodowych oraz rozpoznawania specyficznych właœciwoœ„ genetyenych nie dajšcych się identyfikować przez badanie płynu owodniowego uzyskanego za pomocš amztiopunkcji. Pierwsze doniesienie o pomyœlnie zakflńczonych próbach obserwacjż płodu wewnštrz macicy pochodzš z lat pięćdziesištych (Westin, Mori). Obserwacje te poezyniono za pomocš sondy wprowadzonej do kanału szyjki ma„cy. Walenti (1973 r.) przed histerotomiš wykonywanš w II trymestrze cišży wprowadzał d# pęcherzyka płod4wego nieco zmodyfikowany cystoskop pediatryczny i pod bezpoœredniš kontrolš wzroku pobierał skórę płodu oraz krew z naczyń pępowinowych. Screarngrour (1973 r.) użył optycznego endosk4pu i zbadał 6 płodów obarczonych ryzykiem wady kręgosłupa, których matki chciały cišżę kontynuować, jeœli badanie nie wykazałoby zmian. U jednego płodu z powodu trudnoœci technicznych nie udało się przeprowadzić badania i cišżę przerwano. W drugim przypadku pacjentka poroniła samoistnie w dwa dni po badaniu. W pozostałych przypadkach cišże rozwijały się prawidłowo - trzy pacjentki urodziły dzieci zdrowe, ale czwarte urodziło się z rozszczepem kręgosłupa. Pierwsze badaazie w pełni udane i wykonane w znieczuleniu miejscowym przez brzuszne wejœcie do macicy było dziełem Hobbinsa (1974 r.). Użył on sztywnego endosk4pu (1,7 mm) firmy Dyonics i pod bezpoœredniš kontrolš wzroku pobrał krew płodowš z naczynia kosmka łożyskowego. L Tżywajšc tych samych narzędzi, Rodeck i Campbell pabierali krew płod#247 wš z naczyń pępowiny. Następnie stosowano tę technikę do bezpoœredniej wewnštrznaczyniowej transfuzji krwi w przypadkach konfliktu Rh. Gdy wykonuje się fetosk#pię diagnostycznš, należy pacjentki przed zabiegiem poinformować o celach badania oraz o możliwych powikłaniach i komplikacjach. Następnie należy przeprowadziE dokładne badanże ultrasonograficzne, okreœlajšc wiek cišży, położenie łożyska, położenie płodu oraz wykluczyć duże wady anatomiczne płodu. W wadach sprzężonych z chromosomem X należy wykonać amniocentezę, ponieważ w razie stwierdzenia płodu płci żeńskiej fetoskopia jest nieprzydatna. Chociaż fetoskopia powinna być przeprowadzona w jak najwczeœniejszej cišży, to jednak małe rozmiary macicy i niewielka objętoœć wód pł#dowych nie pozwalajš (ze względu na bezpieczeństwo) na wczeœniejsze wejœcie fetosk4pem niż przed 15 tygodniem cišży. Optymalnym okresem dla badania anatomicznych struktur płodowych jest okres między 15 a 18 tygodniem cišży. Pobieranie krwi płodu zazwyezaj opóŸniamy do 20 tygodnia cišży, ponieważ naczynia pępowinowe bardziej krwawiš z miejsca nakłucia, a utrata krwi płodowej jest proporcjonalnie większa. Po 20 tygodniu obraz staje się zaciemniony (z powodu żmętnienia wód płodowych), jednak jeœli tn k#nieczne, np. w przypadku wewnštrznaeyniowej transfuzji krwi w konflikcie Rh, fetoskopia jest przeprowadzana nawet w III trymestrze cišży. Festoskop jest sztywnš rurkš o œrednicy 1,9 mm z układem stałych, samoskupiajšcych soezewek i włóknooptycznym Ÿródłem œwiatła. Dzięki niemu można uzyskae powiększenie do 30 razy, w zależnoœci od odległoœci oglšdanej tkanki. Wykonanie. W celu zmniejszenia do minimum ruchbw płodu podajemy matce œrodki uspokajajšce. Badaniem ultrasonograficznym okreœlamy położenie płodu, położenie łożyska i zaznaczamy miejsce, w ktbre będzie wprowadzony fetoskop. Umiejscowienie łożyska na przedniej œcianie nie jest przeciwwskazaniem do fetoskopii. Badanie może byE przeprowadzone przez delikatne wprowadzenie fetoskopu pod lub z boku łożyska, a często w tych przypadkach łatwiejszy jest dostęp do naczyń pępowinowych. Po znieczuleniu miejscowym w pełnej aseptyce nacinamy skbrę na długoœci ok. 3 mm, wprowadzamy kaniulę fetoskopu z prowadnicš. PrawidłowoœE wprowadzenia prowadnicy sprawdzamy, obserwujšc czysty, przezroczysty płyn owodniowy. Następnie wprowadzamy do kaniuli fetoskop i obserwujemy płód, ewentualnie wykonujemy biopsję tkanki płodowej. Po zabiegu pacjentki pozostajš pod obserwacjš 1 dobę. Przed wypisem należy przeprowadziE kontrolne badanie ultrasonograficzne, sprawdzajšc stan płodu i objętoœE wód płodowych. Pobieranie krwi płodowej. Krew płodowš w II trymestrze cišży możemy otrzymaE z naczyń kosmkowych lub z naczyń pępowinowych. Poezštkowo pobierano krew płodowš z naczyń kosmkowych, ale częste występowanie trudnoœci technicznych oraz zanieczyszczenie krwiš matczynš spowodowały, że obecnie pobiera się krew naczyń pępowinowych. Aby pobraE krew płodowš, należy wkłuE się do macicy tak, aby uniknšE uszkodzenia łożyska. Po uwidocznieniu w fetoskopie naczyń pępowinowych igłę wprowadza się przez boczny kanał rurki fetoskopowej, przepłukuje fizjologicznym roztworem NaCl w celu wykluczenia obecnoœci płynu owodniowego, pod bezpoœredniš kontrolš wzroku igłę wprowadza się do œwiatła naczynia i pobiera się prbbkę czystej krwi płodowej. Następnie sprawdza się, czy w pobranej prbbce nie ma krwi matczynej. NieobecnoœE jej potwierdza się laboratoryjnie testem Kleihauera. Pobieranie krwi z naczyń pępowinowych jest zwykle łatwiejsze technicznie, pobrana krew nie zawiera na ogbł domieszki krwi matczynej, nie powoduje to większych krwawień. Badanie otrzymanej w ten sposbb krwi płodowej pozwala na szerokš diagno 248 stykę chorób, m.in.: 1) hemoglobinopatii, 2) koagulopatii, 3) bloków metabolicz-ů nych, 4) „nfekcji płodu, 5) ni.egrawidłuwoœci kariotypu, 6) konfliktu Rh - ery= troblastoza płodowa, 7) dystrof mięœniowej Duchenne'a. Bezpoœredni dostęp do kršżenia płodoweg4 już od II trymestru cišży stwarza ogromne możliwoœci lecznicze np. w grzyp.adku konfliktu Rh. BADANIE PŁODU Fetoskopia jest bardzo przydatnym badaniem, szczególnie w przypadkach wštpliwoœci nasuwajšcyeh się w czasie badania ultrasonograficznego. Również w razie stwierdzenia istnienia małych nieprawidłowoœci struktur anatomicz= nych płodu, które nie dajš się rozpoznać ultrasonograficznie. Do najczęœcie# wykrywanych za pomocš bezpoœredniego oglšdania płodu wad należš: defekty twarzy, ršk, kręgosłupa oraz zaburzenia w różnicowaniu płci. W razie stwierdzenia we krwi matki lub w płynie owodniowym zwiększone#: zawartoœci a-fetoproteiny, a niestwierdzenia przy tym żadnyeh nie#prawidłfl= woœci badaniem ultrasonograficznym - fetoskopia jest znakomitym badaniem uzupełniajšcym. nie skóry płodu. Biopsja skóry jest stosowana do prenatalnej diagnozy niektórych dziedzicznych schorzeń skóry, jak: pęcherzyca, rybia łuska. W wielu chorobach zmiany skórne sš częœciš klinicznego obrazu choroby, np. zespół Sj”grena; i w tych przypadkach biopsja skóry za pomocš fetoskopii również znajduje za= sWsowanie. Biopsja wštroby płodu. W niektórych przypadkach biopsja wštroby jest konieczna dla diagnozy choroby, np. stwierdzenia braku karbamoilotransferazy ornitynowej możliwe jest tylko w wštrobie. Brak tego enzymu zaburza cykl moczni= kowy, a intoksykacja amoniakiem powoduje zgon płodów męskich w I tygodniu żyeia. Pierwsze próby wykrycia tego schorzenia za pomocš biopsji wštroby za= kończyły się powodzeniem i badania te sš kontynuowane. Za pomocš tej techniki próbowano diagnozowania niedoboru innych specyficznych dla wštroby enzymów np. w fenyloketonurii. Obecnie fenyloketonuria oraz hiperamonemia typu, III mogš być diagnozowane prenatalnie za pomocš analizy DNA. POWIKŁANIA Fetoskopia wykonywana jest już w wielu oœrodkach medycznych i coraz#. powszechniej stosowana, je.dnak trudno wypowiedzieć się ostatecznie na te= mat stopnia ryzyka. Możliwyxni powikłaniami sš: 1) uszkodzenie dużych naczyń macirznych, 2) uszkodzenie jelit, 3) krwawienia, 4) immunizacja u matek z Rh(-). Ryzyko utraty cišży na dotychczas żebranym materiale okreœla się na około 10, np. Rodeck i Nikolaides na 618 przypadkach mieli 3 zgony płodów w cišgu 48 godzin od badania, tj. 0,5o/o. Pierwszy zgon wkrótce po badaniu# z powodu odklejenia łożyska, drugi z powodu arrznżonżtżs (36 h po fetoskopii poród samoistny), trzeci z powodu błędu technicznego, który spowodował uszkodzenie naczyń łożyskowych i krwawienie. Z pozostałych przypadków 2a/o poroniło w cišgu 5 tygodni po fetoskopii, ale zwišzek przyczynowy trudno okreœlić, gdyż ogblny wskaŸnik samoistnych porodów w tym okresie# cišży wynosi 1,5o/o. Fetoskopię należy traktować jako znakomite badanie uzupełniajšce w diagnostyce prenatalnej oprócz badania ultrasonograficznego i amniopunkcji. Wydaje się jednak, że badanie to znajdzie w przyszłoœci zastosowanie głównie w terapii. W ostatnim okresie wskazanża do fetoskop znacznie się zawężajš. Za 24# stykę chorbb, m.in.: 1) hemoglobinopatii, 2) koagulopatii, 3) bloków metabolicz= nych, 4) „nfekcji płodu, 5) nieprawidłowoœci kariotypu, 6) konfliktu Rh - ery- troblastoza płodowa, 7) dystrofii mięœniowej Duchenne'a. Bezpoœredni dostęp do kršżenia płodoweg4 już od II trymestru cišży stwarza- ogromne możliwoœci lecznicze np. w przypadku konfliktu Rh. BADANIE PŁODU Fetoskopia jest bardzo przydatnym badaniem, szczególnie w przypadkach wštpliwoœci nasuwajšcych się w czasie badania ultrasonograficznego. Również w razie stwierdzenia istnienia małych nieprawidłowoœci struktur anatomicz= nych płodu, które nie dajš się rozpoznać ultrasonograficznie. Do najczęœciej wykrywanych za pomocš bezpoœredniego oglšdania płodu wad należš: defekty twarzy, ršk, kręgosłupa oraz zaburzenia w różnicowaniu płci. W razie stwierdzenia we krwi matki lub w płynie owodniowym zwiększone## zawartoœci a-fetoproteiny, a niestwierdzenia przy tym żadnych nieprawidł-o= woœci badaniem ultrasonograficznym - fetoskopia jest znakomitym badanie. uzupełniajšcym. Badanie skóry płodu. Biopsja skbry jest stosowana do prenatalnej diagnozy nie-któryeh dziedzicznych schorzeń skóry, jak: pęcherzyca, rybia łuska. W wielu cho= robach zmiany skórne sš częœciš klinicznego obrazu choroby, np. zespbł Sj”grena" i w tych przypadkach biopsja skóry za pomocš fetoskopii również znajduje zastosowanie. Biopsja wštroby płodu. W niektbrych przypadkach biopsja wštroby jest konieczna dla diagnozy choroby, np. stwierdzenia braku karbamoilotransferazy orni-ů tynowej możliwe jest tylko w wštrobie. Brak tego enzymu zaburza cykl moczni= kowy, a intoksykacja amoniakiem powoduje zgon płodów męskich w I tygodniu życia. Pierwsze próby wykrycia tego schorzenia za pomocš biopsji wštroby zakończyły się powodzeniem i badania te sš kontynuowane. Za pomocš tej techni= ki prbbowano diagnozowania niedoboru innych specyficznych dla wštroby enzymów np. w fenyloketonurii. Obecnie fenyloketonuria oraz hiperamonemia typu, III mogš byE diagnozowane prenatalnie za pomocš analizy DNA. POWIKŁANIA Fetoskopia wykonywana jest już w wielu oœrodkach medycznych i coraz: powszechniej stosowana, jednak trudno wypowiedzieć się ostatecznie na temat stopnia ryzyka. Możliwymi powikłaniami sš: 1) uszkodzenie dużych naczyń macicznych, 2) uszkodzenie jelit, 3) krwawienia, 4) immunizacja u matek z Rh(-). Ryzyko utraty cišży na dotychczas że#ranym materiale okreœla się na# około 10, np. Rodeck i Nikolaides na 618 przypadkach mieli 3 zgony płodów w cišgu 48 godzin od badania, tj. 0,5o/o. Pierwszy zgon wkrótce po badaniu# z powodu odklejenia łożyska, drugi z powodu áłn1L7.0??,2t?.S (36 h po fetoskopii poród samoistny), trzeci z powodu błędu technicznego, który spowodował uszkodzenie naczyń łożyskowych i krwawienie. Z pozostałyeh przypadków 2o/o poroniło w eišgu 5 tygodni po fetoskOpii, ale zwišzek przyczynowy trudno okreœlić, gdyż ogblny wskaŸnik samoistnych porodów w tym okresie# cišży wynosi 1,5o/o. Fetoskopię należy traktować jako znakomite badanie uzupełniajšce w# diagnostyce prenatalnej oprócz badania ultrasonograficznego i amniopunkcji. Wydaje się jednak, że badanie to zzzajdzie w przyszłoœci zastosowanie głównieů w terapii. W ostatnim okresie wskazanża do fetoskopii znacznie się zawężajš. Za 24# #tosowanie sond molekularnych pozwala okreœlić genotyp płodu na pod-stawie analizy DNA w jšdrach komórek z wód płodowych lub komórek trofoblastu bez uciekania się do pobierania krwi pępowinowej, łożyskowej za pomocš ultrasonografii. Biopsję skóry płodu przeprowadza się pod kontrolš ltrasonograficznš. Za„iegi te stojš na pograńiczu, lub nawet stanowiš poeczštek chirurgii płodu. Ewolucja diagnastyki prenatalnej w kierunku terapii i chirurgii płodu jest optymistycznš wizjš dla rozwoju genetyki klinicznej. Tak wżęc nawet wiele lat prowadzona diagnostyka prenatalna ograni#rzona w większoœci wypadków do wykrywania chorób, których nie potrafiliœmy leczyć, przekształca się w medycynę terapeutycznš i chirurgię płodu. PODSUMOWANIE #Omówiono znaczenie diagnostyki prenatalnej w profilaktyce wrodzonych wad płodu. Zwrócono szczególnš uwagę na schorzenia wywołane aberracjami chromosomalnymi oraz wady oœrodkowego układu nerwowego. Opisano sposób postępowania w prowadzeniu diagnostyki prenatalnej ze zwróceniem :szczególnej uwagi na diagnostykę prenatalnš wad oœrodkowego układu nerwowego. Przedstawiono również zasady rozpoznawania prenatalnie bloków metabolicznych. Zwrócono uwagę, że postęp w zakresie diagnostyki prenatalnej polega na wprowad#eniu ultrasonografii, udoskonaleniu metod barwie.nia chromosomów, techniki hodowli chromosomów oraz wprowadzenia mikrotechnik w batlaniach biochemicznych. Zastosowanie fetoskopii rozszerzyło #akres wykrywanych prenatalnie schorzeń. XVI. Zastosowanie metod genet#ki molekularnej w diagnost#ce chorób genet#czn#ch "Przem#siaw Czerskż Współczesny stan wiedzy o organizacji genomu i strukturze genów uzyskano dzięki opracowaniu technik izolacji fragmentów DNA, ich oczyszczania i anaiizy oraz manipulacji nimi w żywych komórkach. Metody te, okreœlane jako techniki rekombinacjż DNA, sš coraz szerzej stosowane w diagnostyce chorób genetycznych. Jeœt to nowe podejœcie, które różni œię zasadniczo od tradycyjnego p4stępowania. To ostatnie opiera się na badaniu cech fen#typu i WI1'loskowaniu na ich podstawie o genotypie. Diagnostyka z użyciem technik rekombinacji DNA oparta jest na badanżu fizycznych noœników informacji genetycznej i wnioskowaniu na tej podstawie o fenotypie. Zasadniczš zaletš tego postępowania jest możliwoœć rozpoznania chorób genetycznych w okresie przedobjawowym, zanim doszło do ekspresji genów, a więc, zanim eeehy zakodowane w genotypie ujawniły się w strukturze i/albo funkcjach organizmu. Jest to więc postępowanie z wyboru w diagnostyce prenatalnej. W połšczeniu z biópsjš kosmówki można rozpoznać choroby genetyczne płodu w 8 - 10 tygodniu cišży. Można również wczeœnie rozpoznawać choroby, które ujawniajš się w póŸniejszych okresach życia, jak np. plšsawica Huntingtona (typowo po 38 roku życia) lub choroba Alzheimera (65 lat). Mflżna wreszcie rozpoznać predyspozycje do #horób, których ujawnienie się wymaga współdziałania czynników œrodowiska. Postępy w tej dziedzinie sš niezwykle szy^bkie. Roœnie liczba jednostek rozpoznawalnych z zastosowaniem technik rekombinacji DNA. Coraz więcej odczynników, niekiedy w postaci zestawów diagnostycznych, jest dostępnych #v handlu. Metody laboratoryjne ulegajš uproszczeniu i aut#matyzacji. Szczegółowe apisy uległyby szybko dezaktualizacji. Toteż niniejszy rozdział ma na celu krótkie przedstawienie zasad i zastosowań technik rekombinacji DNA w diagnostyce genetycznej według stanu z poczštku 1987 roku. Należy przewidywać, że w najbliższej przyszłoœci zostanš opracowane metody terapii genowej oparte na tych technikach. Obecnie jednak zastosowania te sš w stadium prób doœwiadczalnyeh i omówienńe ich przekracza ramy tego rozdziału. ZASADY TECHNIK REKOMBINACJI DNA 8adania diagnostyczne majš na celu wykazanie obecnoœci lub nieobecnoœci okre#lonych sekwencji nukleotydów zlokalizowanych w okreœlonych obszarach (domenach) genomu. Podstawowym materiałem do badań jest DNA zvyiz#lowany z komórki. Rzadziej bada się DNA zawarty w chromosomach. 2.51 Ostatnio podjęto próby zastosowania do celów klinicznych ilflœciowych badań ekspresji genów. Zawartoœć DNA w badanym materiale można okreœlać za pomocš masy lub liczby par nukleotydów. Ten ostatni sposób dogodniejszy jest dla rozważań molekularnych. Pozwala on na łatwe porównywanie długoœci odcinków DNA i białek, pamiętajšc, że 1 tryplet =1 aminokwas w przypadku egzonów kadujšcych białka. Pojedynczš parę oznacza się skrótem bp (z angielskiego "base pair"), a lOs bp - skrótem kbp lub kb (kilobases). Dla przykładu; zestaw diploidalny DNA człowieka zawiera około 7 X 109 bp. Najczęœciej podawanš liczbš dla genomu człowieka (zestaw haploidalny) jest 3 X 10# bp. Pojedyncze kopie genów majš ok. 2 kb. Powtarzalne sekwencje (repeatytywny DNA) znajdujšce się pomiędzy genami sš długoœci okolo 0;3 kb. W niektórych obszarach, np. heterochromatynie okolicy centromerów, powtarzaln# sekwencje osišgajš 106 bp. Za pomocš ekstrakcji homogenatów komórkowych fenolem i precypitacji etanolem uzyskuje się mieszaninę różnej wielkoœci odcinków DNA, czyli DNA genomiczny. Składa się on z fragmentów zbyt dużych dla dalszej analizy :ub manipulacji. Mniejsze fragznenty uzyskuje się przez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi (restryktazami). Sš to swoiste enzymy, uzyskiwane z bakterii lub grzybów. Restryktazy rozpoznajš okreœlone sekwencje i rozkładajš wišzania fosfodiestrowe pomiędzy okreœlonymi nukleotydami. Uzyskane fragmenty sš więc częœciowo scharakteryzowane przez znane sekwencje w miejscu przecięcia nici DNA (miejscu restrykcji). Bliższš charakterystykę fragmentów uzyskuje się przez okreœlenie ich wielkoœci za pomocš elektroforezy w żelu agarozowym w obecnoœci wzorca - fragmentów o znaneJ wielkoœci lub okreœlenia sekwencji nukleotydów. Do tych celów trzeba jednak uzyskać dostatecznš liczbę kopii fragmentów. Toteż łšczy się je z czšsteczkami DNA majšcymi zdolnoœć do powielania się (replikaeji). Czšsteczki takie, zwane wektorami, wprowadza się do komórek, w których ulegajš namnożeniu wykorzystujšc aparat syntezy DNA gospodarza. Uzyskuje się bibliotekę genów *, z której izoluje się fragment (np. okreœlony gen) za pomoćš techniki klonowania. #'Uyklonowany odcinek DNA można oznakować za pflmocš radioaktywnych izotopów lub cytochemicznych technik. Oznakowany fragment, czyli sonda DNA (w piœmiennictwie anglosaskim "DNA probe"), może być użyty przez zastosowanie techniki hybrydyzacji DNA/DNA do indentyfikacji odcinka DNA, zawierajšceg4 komplementarne sekwencje. P#zwala to na st#vierdzenie obecnoœci poszukiwanego genu lub jego lokalizację. Znajšc sekwencję nukleotydów, można syntetyzować sondy DNA, posługujšc się odpflwiedniš mieszaninš enzymów i prekursorów. Używa się w tym celv automatycznych przyrzšdów sterowanych minikomputerami, w których koduje się żšd„nš sekwencję. Dostępne aktualnie przyrzšdy pozwalajš na syntezę pojedynczych nici długoœci 20 do 100 zasad. Innš technikš produkcji sond DNA jest ich synteza na matrycy mRNA przy uży„u enzymów majšcych zdolnoœć do przepisywania informacji z mRNA na DNA, czyli transkryptaz odwrotnych. Uzyskany tak komplementarny DNA okreœla się jako cDNA. #'Vreszcie znakowanie mRNA i hybrydyzacja RNA/DNA mflgš być użyte do poszukiwania genów. * W starszym piœmiennictw#e spotyka się termin "bank genów", obecnie używa się powszechnie nazwy "biblżoteka genów", rezerwujšc okreœlenie "bank genów" dla przechowywanej w komputerach informacji o sekwencjach nukleotydów zbadanych dotychczas genów (np. program "Genbank" w Bostonie, USA, MA). 252 Bardzo obiecujšcš, lecz wcišż jeszcze kosztownš metodš badańia kariotypu ż geńomu, jest cytofotometria przepływowa wraz z automatycznym sorto- waniem chromosomów. (Opis podano dalej pod tytułem "Cytogenetyka prze- #ływowa".) ZASłOSOWANIE ftESłRYKłAZ Obecnie znanych jest ponad 500 restryktaz. Ponad 100 z nich jest dostępnych w handlu, a ok. 25 używa się rutynowo. Enzymy te oznaeza się skrótami. Pierwsza litera jest pierwszš literš nazwy rodzaju, a dwie następne sš dwoma poczštkowymi literami nazwy gatuziku organizmu, z którego wyizolowano enzym. Czasem dodaje się czwartš literę dla oznaczenia szczepu lub serotypu tego nrganizmu. Cyfra rzymska oznacza chronologicznš kolejnoœć uzyskania restryktazy z tego samego organizmu. Dla przykładu restryktaza otrzymana z Escherżchża colż RY 13 jest oznaczana jako Eco RI, z E. colż TB 14 - jako Eco Tl4I, z St7eptomyces albus jako Sal I, z Hae-wz.ophżlż#w żtzfluenzae szczepu c lub d - jako Hinc I lub Hind I (Hind II, Hińd III) itd. Wyróżnia się trzy typy restryktaz. Każdy z nich wymaga nieco odmiennych warunków reakcji. Typ I i III majš dodatkowš aktywnoœć metylaz. Typ II występuje w układzie z odrębnš czšsteczkš białkowš o aktywnoœci metylazy. Typ I rozpożnaje okreœlone sekwencje nukleotydów, przecina jednak nić DNA w sposób przypadkowy w odległoœ„ 400 do 7000 kb od rozpoznanej sekwencji. Jest więc mało przydatny. Najczęœciej używany typ II prze„na nić w abrębie lub w pobliżu rozpoznanej sekwencji w okreœlonym miejscu. Podobnie działa typ III, miejsce przecięcia znajduje się 25 - 27 bp od rozpoznanej sekwencji. Opracowano rówńież chemiczne i enzymatyczne metody łšczenia końców, które bez przekształcenia się rekombinujš ze sobš. A więc trawienie restryktazami fragmentów DNA o odmiennej treœci informacyjnej i mogšcych pochodzić z różnych organizmów, ale zawierajšcych odpowiednie miejsca restrykcji, prowadzi do uzyskania ad#inków, które rekombinujš ze sobš. Dysponujšc odpowiednim zestawem enzymów i metod, można konstruować fragmenty DNA zawierajšce okreœlone geny ułożone w żšdanej kolejnoœci. Fragmenty te możńa wykorzystać do dalszych badań lub produkcji odczynników do badań w postaci sońd DNA (patrz niżej). Różnoro.dńoœć restryktaz jest wykorzystywana do badania struktury genomu przez okreœlanie długoœci fragmentów DNA otrzymanych po trawieniu i mapowanie miejsc restrykcjż. Stosuje się częœciowe trawienie, pozwalajšce na ujawnienie kolejnych miejsc restrykcji - jedno, dwa, trzy itd., albo trawienie pojedynczymi enzyxnami oraz ich mieszaninš (por. ryc. 107). Kolejńoœć miejsc restrykcji podanš na tej rycinie można potwierdzić znakujšc izotopami radioaktywnymi pojedyncze "wystajšce" nici, dobierajšc reakcje tak, że znakowane sš końce 5' lub 3'. W tym przykładzie (ryc. 107) w œcieżce A (Eco RI) fragment 8 kb może być oznakowany tylko w pozycji 3', fragment 3 kb zarówno w pozycji 5', jak i 3', a fragment 5 kb w pozycji 5' zakładajšc, że fragment wyjœciowy 16 kb ma tępe końce nie dajšce się oznakować. Fragmenty uzyskane po trawieniu można jednoczeœnie znakować za pomocš hybrydyzacji z sondami DNA swoistymi dla okreœIonych chromosomów lub ich odcinków (np. okreœlonych pršżków) lub dla poszczególnych genów. W końcowym wyniku uzyskuje się dane o położeniu genów i miejsc Ryc. 107. Mapowanie. Kolejnoœć miejsc restrykcji z użyciem 2 enzymów. Fragment DNA długoœci 16 kb poddano całkowitemu strawieniu przez Ecs RI (œcieżka A). Hind III (œcieżka á) i ich mieszaninš (œcieżka C). Po elektroforezie w żelu agarozowym uzyskano fragmenty długoœci jak na rycinie. Kolejnoœć miejsc restrykcji Eco ft1 może być: 8, 3, 5 lub 8, 5, 3. Hincl III daje tylko dwa fragmenty (10 i 6 kb), ma więc tylko jedno miejsce restrykcji. Mieszanina daje fragment 6 kb oraz fragmenty 5 kb, 3 kb i 2 kb, łšcznie 10 kb. Kolejnoœć miejsc restrykcji jest więc następujšca: S Hin # III 10 (2 #-- 3 -# 5) g T T (g #. 2) Eco R I 3 Eco ft I 5 restrykcji w stosunku do siebie. Badajšc przekazywanie genów i miejsc restrykcji w kolejnych pokoleniach, mflżna ustalić stopień sprzężenia pomiędzy genem i miejscem restrykcji, tj. sporzšdzić ich mapę genetycznš, posługujšc się klasycznš metodš badania sprzężeń. Jeżeli sprzężenie jest dostatecznie œcisłe, można posłużyć się miejscem restrykcji jako znacznikiem (markerem) dla danego genu. Im więcej miejsc jest sprzężonych z danym genem, tym większe jest prawdopodobieństwo prawidłowego wykrycia genu w badanym materiale z użyciem analizy miejsc restrykcji. Toteż badania nad zastosowaniem tej metody w diagnostyce genetycznej koncentrujš się na poszukiwaniach sprzężeń miejsc restrykcji z genami warunkujšcymi choroby. Jeżeli założyć, że kolejnoœć zasad w DNA jest przypadkowa, to sekwencje rozpoznawane przez restryktazy, jak np. Mbo I lub Tag I, zł#żone z 4 nukleotydów, powinny występować co 4', tj. 256 nukleotydów, a złożone z 6, np. rozpoznawane przez Aat I lub Eco RI. eo 46, tj. 4096 nukleotydów. Sekwencja zasad w DNA nie jest jednak przypadkowa, zwišzana jest bowiem z jego treœciš informacyjnš i procesem ewolucji. Toteż odcinki uzyskane po trawieniu sš różnych długoœci, charakterystycznych dla danego genomu. Mówi się o polimorfizmie długoœci odGinków pomiędzy miejscami restrykcji, okreœlanym angielskim skrótem RFLP (restriction fragment length polymorphism). Przekazywańie sekwencji DNA w czasie replikacji, rekombinaeji mejotycznej i zapłodnienia leży u podłoża praw Mendla, toteż RFLP przekazywany jest zgodnie z tymi prawami Jeffreys i wsp. wykazali w latach 1979 - 1983, że powtarzane sekwencje satelitarnego DNA dajš po trawieniu restryktazami i elektroforezie w żelu agarozowym tak charakterystyczny dla genomu obraz RFLP, że można użyć go do identyfikacji poszczególnych osób, podobnie jak używa się odcisków palców. Toteż mówi się potocznie o "odciskach palców DNA". Znalazłfl to zastosowanie w medycynie sšdowej w dochodzeniu ojeostwa oraz do identyfikacji sprawców przestępstw. "Odciski paIców DNA" podejrzanej osóby porównuje się z DNA fragmentów tkanek znalezionych w miejscu przestępstwa. Wysoki stopień poliformizmu satelitarnego DNA można wyjaœnić nagromadzeniem w czasie ewolucji licznych mutacji. Ponieważ sš to obszary nie kodujšce, mutacje te nie znajdujš odbicia w fenotypie i nie podIegajš selekcji, a więc mogš przetrwać. W obszarach kodujšcych stopień polimorfizmu jest mniejszy. Częœć mutacji bowiem upoœledza zdolnoœć do życia i nie rozprzestrzenia się w popu 254 lacji. Mutacje w miejscu restrykcji (utrata lub pojawienie się miejsca) mogšr być zwišzane z wymianš pary nukleotydów (mutacja punktowa), metylacjš zasady (modyfikacja DNA), wymianš kilku par, delecjš, insercjš lub inwersjš. Badajšc miejsca restrykcji, można niekiedy wykryć mutację punktowš. Klasycznym przykładem jest niedokrwistoœć sierpowatokrwinkowa zwišzan# z obecnoœci hemoglobiny S. W łańcuchu á na pozycji 6 kwas glutaminowy jest zastšpiony przez walinę dzięki mutacji punktowej. W locus á na chromosomie I1 za2niast sekwencji GAG występuje sekweneja GłG, co prowadzi do utraty jednego z miejsc restrykcji Mst II (por. ryc. 108), która rozpoznaje sekwencję CC TNAGG, gdzie N jest dowolnš zasadš. DNA znakujesię sondš swoistš dla genu á-globiny i za pomocš elektroforezy w żelu agarozowym w obecnoœci wzorca bada się długoœć fragmentów uzyskanych pa trawieniu (ryc. 108). l. 15 kc MSł ii ##5# #.:nakowOnie sonch DhA 6 !pio; ';gl !giui i 35 kb #.15 F # #znukowan e SOn#r # h# #. Cl. ; A :7 #Gr # iwal) Ig#ui # r OCrlS #A `pr #### #o"'Y# r.nst r # L oC US P S i#emoglobin## s erpowatej ; Ryc. 108. Schemat zmiany długoœci fragmentu DNA o trawieniu Mst II zwišzane# ze zmianš nekwencji GAG na GłG w niedokrwistoœci sierpawatokrwinkowej, w której na pozycji B w łańcuchu á-globiny występuje walina (wal) zamiast kwasu glutaminowego (glu, pro- prolina). Badany fragment oznakowano radioaktywnš sondš DNA swoistš dla locus á na ehromosomie 11. Obok autoradiogram żelu agarozowego DNA osoby z prawidłowš hemoglobinš A, heterozygot AS i osoby z niedokrwistoœciš sierpowatokrwinkowš (SS). Podobne zjawiska zwišzane sš z szeregiem innych hemoglobinopatii, np: mutacje punktowe w pewnej grupie á-talassem. Inna grupa á- talassemiż zwišzana jest z submikroskopowymi delecjami, które również prowadzš dc zmian miejsc restrykcji. Badanie RFLP znalazło zastosowanie w diagno~ styce prenatalnej hemoglobinopatii. Różnorodnoœć mutacji w okreœlonyrn locus prowadzšcych do powstania fenotypu choroby (różne mutacje locus á-globiny dajšce odmiany nieprawidłowych hemoglobin, zwišzanych z pozornie jednolitš jednostkš á-talassemi) narzuca koniecznoœć badania DNA rodziców przed podję„em diagnostyki prenatalnej. Badanie DNA jest łatwiejsze niż badanie sekwencji aminokwasów w hemoglobinie, toteż badanie DNA probanda i rodziny używane jest do okreœlenia mutacji leżšcej u podłoża choroby. To samo dotyczy wielu innych chorób, jak np. niektórych koagulopatii, pewnych postaci cukrzycy lub dystrofii mięœniowej. Podane wyżej 255 ;przykłady dotyczš ch.orób, w których mutaeje miej.sca restrykcji występujš w obrębie patologicznego genu. Zmiana miejsca restrykcji może być nie tak bezpoœrednio zwišzana ze zmianš fenotypu, jak w przypadku hemoglobiny S. Mutacja zwišzana ze zmianš miejsca restrykcji może dotyczyć intronu lub sekwencji kodujšcych odcinek białka nieistotny dla jego czynnoœci. Intrageniczne zmiany RFLP sš œciœle sprzężone z sekwencjami warunkujšcymi cechę choroby. Niemniej, mog# pocllegać rekombinacji w czasie mejozy. Konieczne sš badania rodzin dotkniętych chorobš i populacji w celu okreœlenia stopnia sprzężenia. Na tej #odstawie okreœla się tzw. zawartflœć informacyjnš polimorfizmu. Pojęcie ta wprowadzone przez Botsteina i wsp. (1980 r.) służy do okreœlenia prawdopodobieństwa trafnaœci rozp#znania na podstawie badania RFLP. W wielu wypadkach gen nie obejmuje miejsc restrykcji, występujš one natomiast w przyległych sekwencjach na skraju genu. Zawartoœć informacyjna jest mniejsza toteż poszukuje się kilku (najczęœciej dwóch skrajnych) miejsc restrykcji sprzężonych z badanym genem. Wreszcie można dysponować sondš DNA ł a b e I a 52. Zestawienie wybranych chorób genetycznych rozpoznawanych za pomocš sond DNA i badania politnorfizmu długoœci fragmentów uzyskanych po trawieniu restryktazami (RFLP) A.Rozpoznawane sekwencje sš położone w obrębie genu (bezpoœrednie rozpoznanie defektów intragenicznych) Koagulopatie (hemofilie, niedabory czynników krzepnięcia) Hemoglabinopatie (np. niedokrwistoœć sierpowatokrwinkowa, á- talassemie) Niedobór a-1-antytrypsyny Cukrzyca Charoba Alzheimera Niedobór hormonu wzrostu Zaburzenia przemiany lipidowej usposabiajšce do chorób serca i naczyń (atherosclerosis) Zespół Ehlersa i Danlosa flsteogen.esis i#mperfecta Zespół Lescha i Nyhana Fenyloketonuria Ret„taoblastonaa Dystrofie mięœniowe (Duchenne'a i pokreame) B.Rozpoznawane miejsca restrykcji sš sprzężone z genem (rozpoznanie poœrednie z zastosowaniem RFLP) Koagulopatie Hemoglobinopatie Cukrzyca (typ II) Niedobór hormonu wzrostu (typ I) Zaburzenia przemiany tłuszczowej (hipertriglicerydemia) Plšsawica Huntingtona Mukowiscydoza Dystrofie mięœniowe C.Sekwencje rozpoznawane sondš DNA i restryktazš sš sprzężone z genem (rozpoznanie poœrednie) Niedorozwój umysłowy sprzężony z łamliwoœciš chromosomu X Plšsawica Huntingtona Dystrofie mięœniowe (dystrofia Duchenne'a, pokrewne i dystrofia miotoniczna; Zespół Menkes Rett#n.oschisis Uwaga: niektóre grupy chorób lub choroby wymienione sš w różnych częœciact tabeli, gdyż te same mutacje mogš byE rozpoznawane za pomocš różnych metoć albo odmienne mutacje leżšce u podłoża tego samego klinicznego obrazu charob# (np. a-talassemie, zespół Lescha i Nyhana, dystrofia mięœniowa typu Duchenne'a wymagajš rozpoznania z zastosowaniem różnych metod. 256 swoistš dla sekwencji występujšcych w sšsiedztwie genu i z nim sprzężonych oraz sprzężonym miejscem restrykcji. Diagnostyka przedobjawowa, oparta na wykrywaniu genu na podstawie sprzężonych sekwencji wykrywanych swoistš sondš DNA i/albo restryktazami, wymaga odpowiedniego przygotowania genetyenego i matematycznego. Badanie powinno obejmować kilku członków rodzżny. Rozpoznanie jest probabilistyczne i acena wyników powinna być dokonana w odpowiednio przygotowanym oœrodku. Przykłady chorób rozpoznawalnych za pomocš sond DNA i badania RFLP podane sš w tab. 52. CzęœE A - podaje przykłady, w których bada się polimorfizmy w obrębie genu, B - sprzężone, lecz położone poza obrębem genu i częœć C - przykłady, w których wykorzystuje się sprzężenia sekwencji położonych poza genem, jednej wykrywalnej za pomocš swoistej sondy DNA i drugiej za pomocš restryktazy. Dla wykrycia obecnoœci chorób wymienionych w punktach B i C tab. 52 znajomoœE molekularnej istoty choroby nie jest konieczna. Wystarczy okreœlić wzajemne położenie badanych sekwencji i poszukiwanego genu na mapie genetycznej oraz ustalić, że sprzężenia sš dostatecznie œcisłe, aby służyć do celów diagnostycznych. KONSłIZUKCJA BIBLIOłEK I SOND DNA. KLONOWANIE Jak to wspomniano na wstępie rozdziału, badania genetyki moIekularnej wymagały uzyskania dużej iloœći jednakowych odcinków ńaturalnego DNA. Metody opracowane w tym celu służš obecnie do produkcji sond DNA do celów diagnostycmych. Materiałem wyjœciowym może być genomiczny DNA albo DNA poszczególnych chromosomów uzyœkanych z międzygatunkowyeh hybryd komórkowych lub za pomocš przepływowego sortera. Trawienie restryktazami pozwala na uzyœkanie fragmentów wielkoœci kilkudziesięciu lub kilkuset bp. Dla uzyskania dostatecznej liczby tych fragmentów wprowadza się je za pomocš wektorów do żywych komórek, zazwyczaj bakterii (najczęœciej E. coli), ale również i komórek eukariotycznych, jak drożdże, komórki myszy lub człowieka. Ryc. 109. Schemat plazmidu pBR322. Oznaczono miejsca przecięcia Aval przez szereg restryktaz i orienBall tacyjnš wielkoœć plazmidu (cyfry wewnštrz koła odpowiadajš liczbie kb). Amp oznacza gen odpornoœci na ampicylinę, Tetna tetracyklinę, Ori - polożełth III I Pvu II nie oœrodka replikacji DNA. I iZat#y's t;enetyki 257 Jako wektůor może służyć czšstec'zka DNA, która: a) ma zdolnoœć do samodzielnego powielania się w cytoplazmie gospodarza, b) zawiera znaczniki (markery), za pomocš których można jš zidentyfikować, oraz c) zawiera odpowiednie miejsca restrykeji pozwalajšce na uzyskanie lepkich końców. Jakc wektory mogš służyć występujšce w naturze w cytoplazmie bakterii bakteriofagi oraz plazmidy. Te ostatnie sš kolistymi fragmentami DNA, wielkoœci kilku kb. Zawierajš one oœrodek replikacji oraz kilka genów nadajšce bakteriom - gospodarzom różne cechy, m.in. odpornoœE na ant#biotyki. Wykorzystujšc naturalne bakteriofagi i plazmidy skonstruowano wiele sztucznych wektorów. W praktyce używa się wektorów dostępnych w handlu luk własnej konstrukeji. Jako przykład może służyć często używany plazmid p BR 322, przedstawiony na ryc. 109. Plazmid ten zawiera oœrodek replikaeji, jeden gen nadajšcy gosgodarzowi odpornoœć na tetracyklinę i jeden gen nadajšcy odpornoœi na ampicylinę oraz szereg miejsc restrykeji. Roztwór czšstek plazmidu, wyizolowanych z bakterii goddaje się trawieniu wybranš restryktazš. Uzyskujc się fragmenty liniowe zakońezone lepkimi końcami. Inkubacja tych fragmentów z roztworem fragmentów ba=danego DNA prowadzi do łšc#enia się zc sobš komplementarnych końców. Badane fragmenty ulegajš włšczeniu dc plazmidu, który ponownie przyjmuje postać kolistš. W praktyce często konieczne jest przeprowadzenie dodatkowych reakeji tj. inkubacji roztworów w odpowiednich warunkach z dodatkowymi enzymami (grzede wszystkim enzymem swoistym, ligazš DNA), aby uzyskać włšczenie obcego DNA i zamknięcie koła plazmidu. Manipulacje sš proste i sprowadzajš się do inkubacji probówek z adpowiednim roztworem we właœciwe; temperaturze przez okreœlony czas. Rycina 110 przedstawia sehemat reakeji, w wynik2x której powstajš zrekombinowane plazmidy. Nadajš one ad#ornoœć na tylko jeden antybiotyk zamiast na dwa, jak plazmid wyj#ciowy. Odpowiedni szezep bakterii zostaje zakażony plazmidamż. Hodowla tych bakterii na podłożach z antybiotykami i pozwala na wyselekejonowanie kolonii, które zawierajš zrekombinowane plazmi.dy. Wysiewajšc bakterie w odpowiednżm stężeniu na płytki Petriego z podłożem agarowym, otrzymuje się kolonie pochodzšce z pojedynezej komórki macierzystej, czyli klony. Wyselekejonowane na właœciwych podłożach pos#czególne klony zawierajš zrekombinowane plazmidy, do których włšczone zostały odmienne fragmenty obcego DNA. Pojedynezy klon może również zawierać odmienne zrekombinowane plazxnidy. Zestaw hodowli komórkowych w których namnażane sš wektory zawierajšce pewien zestaw odmiennycl fragmentów obcego DNA, nosi nazwę biblioteki genów lub fragmentów DNA Dysponujšc odpowiedniš liczbš bakterii, można częœć biblioteki użyć do izolacji DNA wektorów. Wbudowane fragmenty można wycišć restryktazami rozdzielić według wielkoœci i okreœlić sekweneję nukleotydów. Stosujšc te chniki analityczne, preparatykę DNA i powtarzanie rekombinacji i klonoů wania mnżna uzyskaE klon bakterii, w którym powielajš się wektory zaů wierajšce pojedynezy identyczny odcinek DNA, czyli wyklonować fragmen DNA. Fragment ten m#żna oznakować izotopami radioaktywnymi lub cyů tochemicznie i użyć do identyfikacji komplementarnych sekweneji za pomoc# techniki hybrydyzacj i. Majšc do dyspozycji oznakowany fragment, czyli sondę DNA, można wrócić #do biblioteki i w#braE z niej klony zawierajšce interesujšcy fragment Po sprawdzeniu czystoœeń klonów można je powieliE i uzyskać pokaŸnš liczů bę identycznych odcinków DNA. Sehemat postępowania w trakcie klonoů 258 p BR 323 D #y #A Pst I # * t 1 1 Ryc. 110. Plazmid pBR 322 poddano trawieniu Pst II lub Sal I, których micjsca restrykcji znajdujš się w genach odpornoœci na antybiotyki. Inkubacja z obcym DNA o odpowiednich lepkfch końcach prowadzi do włšczeńia fragmentów do jcdnego z tych genów i utraty odpornoœci na odnoœny antybiotyk. W wyniku tej rekombinacji powstajš plazmidy nadajšce odpornoœć tylko na jeden antybiotyk i zawierajšce obcy DNA. wania fragmentów eukariotycznego DNA z użyciem Z. coli praed#tawia ryc. 110. Powyższy opis przedstawia zasadę izolacji i namnażania kionu odeinka DNA. Do oznakowania wektorów używa się różnych antygenów, np. nadajšcych okreœlone cechy metaboliczne lub antygenowe. Stosuje się różne podłoża selekcyjne i metody immunologiczne selekcje klonów. Jako wektory mogš służyć fagi, różnorodne wirusy i wektory sztuezne, jest również wiele dostępnych szczepów k.omórek - gospodarzy. Schemat postępowania jest analogiczny. Jest ono pracochłorme. U#yskanie czystego klonu DNA wymaga opracowania od kilkuset do kilkunastu tysięcy hodowli komórkowych. Do konstrukcji bibliotek można również użyć DNA otrzymany z aastosowaniem transkryptaz odwrotnych z mieszaniny różnych mRNA. Można również wbudować do wektora syntetyany odcinek DNA. W tym wypadku oznakowany odpowiednio materiał wyjœciowy może służyć jako sonda DNA do identyfikacji klonów, w których namnoży œię zrekombinowany wektor. Postępowanie ulega znacznemu uproszczeniu. Jeżeli użyć odpowiednżch szczepów komórek-gospodarzy i wektorów, wprowadzony #en może ulegać transkrypcji i translacji. Uzyskuje się produkcję okreœlonego 'białka, które można wyżzolowaE i 4czyœcić. Metoda ta jest uży259 wana do produkcji wielu enzymów (m.in. niektórych restryktaz, wielu enzymów przemysłowych, stryptokinazy), biol#gżcznie czynnych białek (np. interferony, czynniki krzepnięcia, antybiotyki) i hormonów (np. insulina, hormon wzrostu). Wzrasta liczba i iloœE œradków leczniczych produkowanych przy użyciu technik rekombinacji DNA. Sondy DNA lub RNA wyprodukowane dzięki tym technikom znalazły zastosowanie w diagnostyce chorób bakteryjnych i wirusowyeh oraz okreœlaniu odpornoœci na antybiotyki. TECHNIKI IiYBRYDYZAC Jl W odpowiednich warunkach (pH, siła jonowa i temperatura œrodówiska) pojedyncze nici DNA lub RNA wišżš się za pomocš wišzań wodorowych z nićmi DNA lub RNA, zawierajšcymi komplementarne sekwencje nukleotydów. Zjawisko to nosi nazwę hybrydyzacji. Podwójne nici mogę się rozpadaE, czyli denaturować, przy zmianie warunków. Najezęœciej stosuje się denaturację termienš. Pojedyncze nici uzyskane przez denaturację mogš ponownie łšczyć się ze sobš (renaturować, hybrydyzowaE) przy zmianie warunków (np. obniżeniu temperatury). St„bilnoœć podwójnych nici zależy od warunków œrodowiska. Manipulujšc nimi można uzyskać hybrydyzację tylko nici œciœle zgadnych ze sobš lub częœciowo knmplementarnych. Podstawowe etapy hybrydyzacji DNA w laboratorium sš następujšce: I. Badany fragment podwójnej nici DNA poddaje się denaturacji i uzyskane pojedyncze nici wišże się ze stałym podłożem (np. błonš z nitrocelulozy), 2. Następnie dodaje się roztwór pojedynczych nici oznakowanych izotopami ra#ioaktywnymi lub chemicznie, eyli roztwór sondy DNA (RNA). Sonda wišże się z nićmi zawierajšcymi komplementarne sekwencje w sposób bardziej lub mniej swoisty, zależnie ód warunków. Zazwyczaj dšży się do uzyskania bardzo swoistej h#brydyzacji. 3. Nie zwišzane z badanym materiałem fragmenty sondy usuwa się przez płukanie w odpowiednich roztworach. 4. Zwišzane ze stałym podłożem kómpleksy podwójnych nici powstałe na skutek hybrydyzacji wykrywa się za pomocš autoradiografii lub odpowiedniego barwienia. Jest to tak zwana punktnwa techniki bibułowa. Eardziej precyzyjnš technikš jest metada opisana pxzez E. M. Southerna. Terhnika ta poczštkowo służyła do badania hybryd DNA/ftNA i z pewnymi modyfikacjami do badania białek. Southern oznacza po ang9elsku "południowy". Toteż pobocznie mówi się o technice bibułowej południowej (Southern blot), jeœli bada się hybrydyzaeję DNA/DNA, północnej (Northern blot), jeœli bada się hybrydy DNA/ /RNA, i zachodniej (Western blot), jeœli bada się białka. Technika półudniowa obejmuje następujšce etapy (ryc. Ill). 1. Izolacja i oczyszczenie DNA z komórek człowieka. 2. Trawienie restryktazami w celu uzyskania mieszaniny fragmentów o dogodnej wielkoœci. 3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów według wielkoœci. 4. Przeniesienie fragmentów z żelu na filtr z nitrocelulozy lub z nylonu; z zachowaniem ich rozmieszczenia; niezwykle 2legancka, dzięki swej prostocie, metoda Southerna przedstawi#na jest na ryc. 112. 5. Denaturacja fragmentów DNA i hybrydyzacja z sondš (technika południowa); nici RNA sa pojedyn#e, nie wymagajš denaturacji, przeprowadza sie tylko hybrydyzacj# (technika pó#nocna); w przypadku białek (technika Ryc. 111. Schemat klonowania genomicz- Ryc. 112. Schemat postępowani.a #w "ponego DNA człowieka w komórkach ludniowej" technice bibułowej ("SoutEschertchia co1% (patrz tekst). hern blot"), patrz tekst. zachodnia) przeprowadza się reakcję wišzania znakowanych przeciwciał zwróconych przeciwko poszukiwanym grupom antygenowym. 6. Ustalenie poł4żenia fragmentów oznakowanych sondš lub przeciwciałem z użycżem autoradiografii, reakcji barwnych lub fluorescencji, zależnie od typu oznakowania sondy lub przeciwciała. Hybrydyzację można przeprowadzać w roztworze. Następnie trzeba wyizolować kompleks złożony z podwójnej nici DNA/DNA lub RNA/DNA. Za pomocš okreœlenia radioaktywnoœci lub fotometrii można oznaczyć liczbę hybrydyzujšcych sekwencji, np. fotokop badanego genu lub mRNA. Wresz„e można przeprowadzać hybrydyzację żn sżtu w mikroskopowych preparatach na szkiełku podstawowym lub w preparatach płytek metafazalnych, sporzšdzanych tak samo jak dla celów cytogenetycznych badań kariotypu. Przeprowadza się denaturaeję, hybrydyzację, a następnie wykrywa się obecnoœć i lokalizację sondy za pomocš autoradiograf, metod cytochemicznych lub fluorescencji. Hybrydyzacja żtz sżtu może służyć do lokalizacji genów w chromosomach. Ann Henderson i wsp. (1973 r.) po raz pierwszy zaœtosowali hy261 Filtr z nitro#wiozy --#-, Rye. 113. Technika przenoszenia fragmentów rozdzielonych elektroforetycmie w żelu agarozowym opracowana przez E. M. Southerna. O brzegi naczynia z buforem opiera się płytę szklanš, na którš nakłada się pasek bibuły filtracyjnej. Jego brzegi zanurza się w buforze i pasek służy jako knot wysysajšcy roztwór. Na pasek nakłada się żel. Na nim umieszeza się duże warstwy bibuły filtracyjnej, na które nakłada się warstwę ręczników papierowyeh, odpowiednio przyciętych. Na wierzeh n#kłada się drugš płytę, obcišżonš odpowiednim eiężarem. Dzięki sile włoskowatoœci powstaje pršd buforu, który wymywa fragmenty z żelu i osadza je na filtrze z nitrocelulozy. brydyzację RNA/DNA do lokalizacji genów człowieka. Wykazali oni, że rybosomalny DNA hybrydyzuje z odcinkami DNA p#łożonymi w nóżkach satelitów chromosomów akrocentrycznych. Stšd geny kodujšce rybosomalny RNA zlokalizowane sš w tej okoliey. Sondy DNA sš obecnie szeroko stosowane do mapovsania genów w chromosomach. Jako sond używa się wyklonowanych fragmentów genów, mRNA lub cDl\łA. Jeœli sekweneje w obrębie mutacji sš znane i mutacja jest punktflwa lub dotyczy kilku zasad, rnożna posłużyć się sondami syntetycznymi. Składajš się one z kilkunastu lub dwudziestu paru nukleotydów (sondy oligonukleotydowe). Sondy takie sš używane w diagnostyce hemoglobinopatii, np. á-talassemii, w której opisano 23 mutacje prowadzšce do powstania obrazu choroby. Sondy takie służš również d# diagnostyki prenatalnej niedoboru a-1-anty#rypsyny i ok. 30o/o przypadków choroby lub nosicieli fenyloketonurii. W pzzypadkach tych występuje mutacja na końcu 5' intronu 12 genu hydroksylazy fenylolaninowej, polegajšca na zastšpieniu guaniny przez adeninę. W pozostałych przypadkach nie ustalono jeszeze rodzaju mutacji. Niektóre choroby zwišzane sš z różnorodnymi mutacjami. Jako przykład mogš służyć dystrofie mięœniowe typu Duchenne'a i pokrewnych lub zespół Leseha i Nyhana. Ten ostatni zwišzany jest z niedoborem fosforybosyltransferazy hipoksantyno-guaninowej. Gen tego enzymu jest duży, długoœci 44 kb, i w dotychezas zbadanych 18 przypadkach w każdym zmiana sekweneji była odmienna. Przykłady te zostały przytoczone dla podkreœlenia koniecznoœci badań ro262 dziny w przypadku ustalenia rozpoznania z użyciem metod wykrywajšcych mutacje punktowe. Jednoczeœnie przykłady te wykazujš, że metod tych nie mażna stosować jako testów przesiewowych dla wykrywania nosicieli lub œwieżych mutacji. Toteż z nielicznymi wyjštkami, jak niektóre hemoglobinopatie, na razie bardziej przydatne sš w diagnostyce sondy większej długoœci i badania sprzężeń z ftFLP lub ze zmianami w sekwencjach nie zwišzanych bezpoœrednio z istotš chorób. Używa się m.in. sond anonimowych. Hybrydyzujš one z DNA okreœlonych chromosomów lub pršżków w ich obrębie, jednak bliżœza struktura i funkcja odcinków wykrywanych sondami anonimowymi nie jest znana. Sondy anonimowe mogš służyć w cytogenetyce do wykrywania submikroskopowych delecji, insercji lub translokacji; jak również w cytogenetyce przepływowej. ZASłOSOWANIE SOND DNA I HYBRYDYZACJI Najczęœciej stosowanš metodš oznakowania sond jest wprowadzenie izotopów radioaktywnych. Ogranicza to jednak możliwoœć szerokiego zastosowania, gdyż laboratorium wykonujšce takie badania musi odpowiadać wymogom bezpieezeństwa pracy z materiałami radioaktywnymi. Szerokie zastosowanie w rutynowych małych laborat#riach będzie możliwe po opracowaniu dobryeh metod z#akowania sond za pomocš zwišzków wykrywanych reakcjami barwnymi lub z zastosowaniem fluorescencji. Prowadzi się intensywne poszukiwania takich metod. Jednš z nich jest wprowadzenie do końca sondy bocznego łańcucha 16 tymidyn, do których włšczono biotynę. Łšczy się ona w sposób swoisty z awidynš, kt&ra przyłšczać może kilka czšstek biotyny. Awidyna włšczona do sondy ma jeszcze wolne miejsca wišzania biotyny. Toteż kompleks sonda DNA/DNA badany/biotyna/awidyna można wykryć dołšczajšc do niego biotynę sprzężonš z kilkoma czšsteczkami fosfatazy alkalicznej. Tę wykrywa się za pomocš typowej reakcji barwnej z błękitem nitrotetrazolowym. Kompleks można wylfrywać również za pomocš swoistych przeciwciał zwróeonych przeciwko awidynie i sprzężonych z fluorochromem (metodš immunofluorescencji). Ta ostatnia metoda używana jest w cytogenetyce przepływowej. Niestety, sondy oznakowane biotynš/awidynš sš mniej swoiste i czułe niż sondy oznakowane izotopami radioaktywnymi. Zastosowanie sond w diagnostyce genetycznej jest duże. Szeroko stosuje się sondy DNA lub RNA w diagnostyce bakterii i wirusów. Używa się hybrydyzacji wyizolowanego z badanego materiału DNA lub RNA w roztworze lub punktowej techniki bibułowej. Liczba mikroorganizmów wykrywanych sondami stale roœnie. Wymienić można wirusy hepatżtżs A i B. Epstein-Barr, cytomegalowirus, herpes, papillomawirusy, wirus nabytego niedoboru odpornoœci (AIDS) i wiele innych. Opracowano sondy dla PZaz#rrodżu#n, faLciparun'c (malaria) i wielu leiszman; w opracowaniu jest sonda do wykrycia trichinozy. I.ista bakterii jest bardzo długa, obejmuje m.in. i Salłnonellae, Klebsżellae, Le#żortellae i różne Mycobacterża, m.in. Mycobacterżu#n, tuberculosżs. W tym ostatnim przypadku podkreœlić należy, że hodowla i próby biologiczne wymagajš kilku tygodni, podczas gdy wykonanie badania przy użyciu sondy DNA - kilku godzin. Wreszcie dodać należy, że sekwencje genów odpornoœci na antybiotyki s# znane. Wiele firm op-racowuje obecnie zestawy sond do wykrycia tych genów w badanych bakte 263 riach. Zestawy te powinny pozwolić na ustalenie odpornoœci na antybiotyki w cišgu godziny lub dwóch. Wreszcie sondy DNA i metody jego rekombinacji znalazły szerokie zastosowanie w onkologii. Sondami można wykrywać onkogeny i co ważniejsze, badać liczbę ich kopii oraz lokalizację. Badanie amplifikacji onkogenów w raku sutka służy do celów prognostycznych i pozwala na wyróżnienie okresu, w którym powstajš przerzuty. Omówienie zastosowań rekombinacji DNA w diagnostyce onkologicznej wymaga odrębnego rozdziału i przekraeza ramy niniejszego. Wspomnieć tylko należy o genie zwišzanym z retżnoblasto#m,a. Jest on położony na ramieniu długim chromosomu 13 w pršżku ql4.1 i jego sekwencja jest znana. Delecja tego genu powoduje nowotwór. Można więc podejrzewać, że jest to gen niezbędny do kontroli i regulacji proliferacji komórek. Badanie sondš DNA pozwala na ustalenie rozpoznania w okresie przedobjawowym. CY'rOGrENEłYliA PftZEP#YWOWA Cytogenetyka przepływowa wywodzi się z cytofotometr przepływowej. Najprostsze urzšdzenie do pomiaru œwiatła wzbudzonego (fluorescencji) i œwiatła wzbudzajšcego (zazwyczaj monochromatyczne pr4mienrowanie w paœmie nadfioletu) przedstawiono na ryc. 114. Szybkoœć przepływu chromosomów i pomiarów sš tak dobrane, że uzyskuje się wykres pochłaniania (emisji) na Ryc. 114. Schemat cytofotometru przepływowego z urzšdzeniem do sortowania ehromosombw. Płyn z zawiesinš chramosomów jest wprowadzany pod ciœnieniem do komory przepływ#wej, z której wypływa w postaci kropli. Wielkoœć kropli jest tak dobrana, żeby każda zawierała tylko jeden chromosom. lirople przepływajš przez promień monochromatycznego œwiatła lasera. Swiatło wzbudzajšce i œwiatło wzbudzonej fluorescencji jest mierzone przez fotopowielacze (œwiatło jest rozszczepione na dwa promienie i przepuszczane przez odpowiednie filtry). Krople przepływajš między dwiema płytkami o wysokim ładunku elektrycznym sterowanym z minikomputera. Po rozpoznaniu sygnału (natężenie i grofil liniowy pochłoni#tego lub wzbudzonego œwiatła) krople zawierajšce poszukiwane chromosomy sš odchylane elektrostatycznie i zbierane w naezyniach. 264 przestrzeni długoœci chromosomu. Sygna#y z układów pomiarowych sš zapisywane w komputerze. Ten sam komputer steruje wielkoœciš i znakiem ładunku elektrycznego na płytkach elektrostatycznie odchylajšcych krople ze strumienia kropli wtryskiwanych pomiędzy płytki. M#żna odchylać krople zawierajšce chromosomy o wybranej charakterystyce i zbierać je w naczyniach. Zasada urzšdzenia jest prosta, ale wymaga ono skomplikowanych elementów elektronicznych i jest kosztowne. Istniejš urzšdzenia kaskadowe, w których sort,owanie jest powtarzane kilka razy. Mflżna wbwczas dokonać seiekcji chromosomów według wielu kryteriów. Urzšdzenie na ryc. 114 pozwala na sortowanie z uwzględnieniem dwóch zmiennych. Ghrumosomy do tych badań izoluje się z komórek znaj#ujšcych się w trakcie mitozy przez zawieszenie w odpowiednim œrodowisku i wirowanie różnicowe. Do scharakteryz.owania chromosmów można się posłużyE pochłanianiem nadfioletu w DNA i posegregować je według zawartoœci kwasów nukleinowych. M#żna również posłużyć się chromosomami zabarwionymi barwnikami fluorescencyjnymi, np. używanymi w mikroskopie do badania pršżków. Wykres intensywnoœci wzbudzonego œwiatła na przestrzeni długoœci chromosomu odpowiada wzorowi pršżków. Można więc uzyskae kariotyp pršżkowy badanych chrůom.osomów. Zawiesina chromosomów badana w ten sposób zawiera przypadkow# mieszaninę chromosomów z różnych kflmórek. Toteż należy zbadać duża liczbę chromosomów i przeprowadzić analizę statystycznš wyników, aby uzyskać kariotyp badanej osoby. Operacje rachunkowe sš wykonywane w komputerze. Hybrydyzacja badanych chromosomów ze swoistymi sondami DNA, oznakowanymi fluorescencyjnie, pozwala na dalszš szaegółowš charakterystykę. Niezależnie od celów anality#ych (badania kariotypu i genu), urzšdzenia te mogš służyć do izolacji poszczególnych prawidłowy#h lub nieprawidłowych chromosomów, które mogš być następnie użyte do konstrukcji bibliotek DNA, jak to opisano wyżej. Trzeba się zastrzec, że cytogenetyka przepływowa wymaga jeszcze udoskonaleń. Metoda jest w praktyce jeszcze trudna i nie zawsze tak precyzyjna, jakby wynikało z opi#u. Jest to metoda przyszłoœci, pod warunkiem, że zostanie bardziej wystandaryzowana i że aparatura będzie tańsza. PODSUMOWANIE Zastosnwanie rekombinacji DNA do metod diagnostycznych pozwala na wycišganie wniosków co do rozpoznania, częst# prognozy na podstawie badania fizycznych noœników informacji genetyeznej (chromosomów, DNA mRNA). W skró„e myœlowym można powiedzieć, że na podstawie genotypu wycišga się wnioski o fenotypie. Gechy te nie muszš być wyrażone. Rozpoznanie można ustalić w okresie przedobjawowym. Jest to więc postępowanie z wybtrru w diagnostyce prenatalnej. S#ownik najezęœciej używan#ch terminów genet#czn#ch Krzysztof Boczkowwski Aberracja chromosomalna - nieprawidłowoœć w liczbie lub strukturze chromosomu. Allele - alternatywne formy danego genu, zajmujšce to samo miejsce (locus) w parze chromosomów. Każdemu chromosomowi (z wyjštkiem chromosomów X i Y u mężezyzny) odpowiada drugi homologiczny chromosom, dlatego też każdemu genowi odpowiada drugi gen, położony w identycznym miejscu w homologicznym chromosomie. Geny położone w identycznyeh miejscach w homologicznych chromosomach nazywamy allelami. Amniopunkeja - nakłucie pęcherza płodowego przez powłoki brzuszne albo przez pochwę. Anafaza - przedostatnia faza mitozy lub mejozy, w czasie której chromatydy (lub chromosomy w I podziale mejotycznym) wędrujš do przeciwległych biegunów komórki. Aneuploidia - brak albo nadmiar jednego lub kilku chromosomów w stosunku do liczby podstawowej dla danego gatunku. Artygen - substaneja wzbudzajšca powstanie przeciwciała i/lub wykazujšca swoistš z nim reakeję. Asocjacja - stowarzyszenie - łšczne występowanie dwóch cech istotnie częstsze niż # losowe. Biotyp (Johansse#, 1903) - grupa osobnikbw identycznych pod względem składu genetycznego. Bi#valent - para homologicznych chromosomów w okresie ich koniugacji podczas I podziału mejotycznego. Liczba biwalentów odpowiada połowie liczby chromosomów normalnej diploidalnej kombrki somatycznej. BliŸnięta - dwa osobniki rozwijajšce się w przebiegu tej samej cišży i pochodzšce z jednej komórki jajowej (bliŸnięta monozygotyczne) lub z dwóch komórek jajowych (bliŸnięta dizygotyczne). BliŸnięta monozygotyczne sš jednakowe pod względem genetycznym, natomiast stopień pokrewieństwa genetycznego bliŸništ dizygotycznych jest taki sam jak między rodzeństwem. Cecha (Bateson, 1909) - każda właœciwoœE (fenotypowa) organizmu: bioehemiczna, anatomiczna, psychiczna itp. U jej podłoża leży informacja genetyczna, której realizacja zależy jednak od warunków œrodowiska. Cechę możemy okreœlić jako autosomalnš lub sprzężonš z płciš (z chromosomem płciowym), dominujšcš lub recesywnš, jednogenowš lub wielogenowš itp. Centromer - heterochromatyczne miejsce chromosomu, w którym łšczš się jego chromatydy i do którego przyczepiajš się włókna wrzeciona kariokinetycznego podezas mitozy lub mejozy. Nazywany jest rbwnież przewężeniem pierwotnym. 266 Chimera (Winkler, 1807) - mozaika idiotypowa, najczęœciej roœlinna, rzadziej zwierzę, które ma tkanki dwbch lub więcej idiotypbw. Chimery mogš powstaE w wyniku mutacji, somatycznej segregacji lub przeszczepiania. U człowieka powstaje w wyniku podwójnego zapłodnienia komórki jajowej albo wymiany między dwoma zygotami lub ich połšczenia albo przeszcżepienia tkanki czy narzšdu. Chromatyda - jedna z dwu jednostek podłużnych, z jakich składajš się chromosomy od okresu syntezy aż do metafazy mitotycznej lub metafazy II podziału mejotycznego; potem staje się chromosomem potomńym. # Chromatyna - substancja jšdra komórkowego barwišca się b„rwnikami zasadowymi i składajšca się z chromosomów. Chromatyna płciowa - chromatyna płciowa X (ciałko Barra) - płaskowypu#ła grudka chromatyny, położona przy błonie jšdrowej komórek żeńskich, majšcych ponad jeden chromosom płciowy X. Odpowiada allocyklicznemu chromosomowi X w stadium interfazy. Chromosom - struktura, zawierajšca ułożone kolejno geny, ktbre warunkujš właœciwoœci dziedziczne we wszystkich proto- i eukariotycznych systemach genetycznych. Chromosomy sš strukturami samoodtwarzajšcymi się (autoreplikacja), a ich liczba w komórce, kształt i organizacja sš charakterystycznymi cechami gatunkowymi. Ciałko Barra - patrz chromatyna płciowa. Ciałko Y - jasno fluoryzujšca grudka widoczna w jšdrach komórek męskich, która powstaje w wyniku silnej fluorescencji częœci dystalnej ramion długich chromosomu Y. Cis-trans efekt - gdy dwa allele (pseudoallele) znajdujš się obok siebie ńa tym samym chromosomie (pozycja cżs) - ńie powodujš one zmian fenotypowych; natomiast gdy znajdujš się na dwóch homologicznych chrqxnosomaćh (pozycja trans) - powodujš powstanie żmian fenotypowyeh. Crossing- over - przekrzyżowanie - morfologiczny wyraz rekombinacji. Cytogenetyka - dział genetyki badajšcy chromosomy metodami cytomorfologicznymi. Zajmuje się zarówno liczbš i kształtem chromosomów, w. kt&rych zawarty jest materiał genetyczny, jak i jego przekażywaniem w procesie mitozy i mejozy, oraz okreœlaniem nieprawidłowoœci chromosomalnych u osobnikbw. Defekt wrodzony - anomalia obecna w chwili urodzenia, ktbra może 6yE spowodowanaczynnikami genetycznymi i/lub czynnikami œrodowiskowymi z okresu prenatalnego. Dełecja - ubytek częœci chromosomu. Denaturacja DNA - tworzenie jednoniciowych łańcuchbw z podwójnej (dwuniciowej) helisy DNA. De novo - powstanie  osobnika mutacji, np. aberracji chromosomalńej "na nowo" (nie została przekazana mu przez rodziców). Dermatogłify - #vżóry listewek skórnych ń„ dłoniach i stópaćh, genetyczńie i' f#dywidualnie œwoiste. Diploid - komórka lub organizm zawierajšcy dwa zespoły homologicznycli chromosomów (jeden od ojca, a drugi od matki); u człowieka liczba diploidalna chromosomów wynosi 46. DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy - polimer złożony z dezoksyrybonukleot.ydów, w ktbrym zakodowana jest informacja genetyczna komórki. Dominacja - uwidacznianie się cechy w stanie heterozygotycznym, tzn. gdg allele sš odmienne, wówczas uwidacznia się cecha okreœlana przez allel dominujšcy. Dryfgenetyczny - losowa zmiana częstoœci genów w populacji, zarówno ukierunkowana, jak i nie ukierunkowana, istoina żwłaszcza dla małych populacji gdyż może doprowadziE do utrwalenia #edneg# z ałleli i wykluczenia drugiegó, niezależnie od ich wartoœci adaptacyjnej. 267 Duplikacja - podwojenie fragmentu chromosomu, ramion chromosomu (izochro- mosom) albo całego chromosomu, lub kilku chromosombw (aneuploidia). Dziedzicznoœć - przekazywanie informacji genetycznej przez rodziców potomstwu. Genetyka jest naukš o dziedzicznoœci. E#zon - odcinek genu zawierajšcy nukleotydy ulegajšce transkrypeji w czasie syntezy białka. Endonukleazy - enzymy atakujšce łańcuchy kwas&w nukleinowych wewnštrz łańcucha polinukleotydowego, patrz nukleazy. EksDresja - wyrazistoœć, forma lub stopień ujawniania się okreœlonego gen lub #rupy genów w fenotypie nosiciela lub nosicieli, okreœlana jakoœciowo lub iloœciowo. Epiaom - element genetyczny, będšcy czšsteczkš DNA, który nie jest koniecznym składnikiem kombrki. Episom może istnieE w dwbeh stanach: 1) w stanie zintegrowanym - w którym stanowi on częœć chromosomu #ospodarza replikujšcy się jako częœE tego chromosomu oraz 2) w stanie autonomicznymw którym replikuje się niezaletnie i niekiedy szybciej od chromosomu gospodarza. Episom, który utracił zdolnoœE łšczenia się z chromosomem, staje się plazmidem. Epistaza (Bateson, 1907) - forma wspbłdziałania genbw, polegajšca na oddziaływaniu jednego genu na fenotypowš ekspresję innego genu lub genów nieallelicznych w taki sposbb, że fenotyp jest uwarunkowany tylko przez ten jeden gen. Geny, których przejawianie slę zostaje zniesione pod wpływem innych genbw nieallelicznych, okreœla się jako hipostatyczne lub wykazujšce hipostazę. Euchromatyna - chromosomy lub ich częœci, w których cykl spiralizacji przebiega typowo, warunkujšc normalny sposbb barwienia się barwnikami zasadowymi w odrbżnieniu od heterochromatyny. Eu##nlka (Galton, 1883) - nauka o, poprawianiu rasy ludzkiej". Eukarionty - roœliny i zwierzęta zbudowane z kombrek zawierajšcych jšdro oddzielone błonš jšdrowš od cytoplazmy. Euploidy - komórki, tkanki lub organizmy z pełnym, typowym dla danego gatunku, pojedynezym zestawem chromosomów (monoploidy) albo z jego wielokrotnoœciš (diploidy lub poliploidy), przy czym każdy chromosom występuje tylko raz w danym zestawie. Faá - inaczej bakteriofag, czyli wirus bakteryjny. FI-F= - kolejne pokolenia potomne, wywodzšce się od okreœlonej pary rodzicbw. Fenokopia - powstajšca pod wpływem œrodowiska modyfikacja fenotypu, naœladujšca cechę lub cechy uwarunkowane genety-cznie. FenotyD - a) strukturalne i czynnoœciowe właœciwoœci organizxnu, powstałe w wyniku współdxiałania genotypu i œrodowiska; b) dajšca się stwierdziE morfologicznie lub czynnoœciowo charakterystyka okreœlonej ceehy. Filogeneza - rozwój rodowy organizmbw, czyli historia powstawania zarówno poszezególnych naturalnyctt grup organizmów, jak i całe#o œwiata roœlin i zwieů Tzšt. - - Gatunek - podœtawowa jednostka w systematyce roœlin i zwierzšt, obejmujšca organizmy majšce wspblnš pulę genbw oraz mogšce krzyżowaE się między sobš i mieE płodne potomstwo. Gameta - dojrzała komórka rozrodeza (niekiedy tylko jšdro kom&rkowe) o haploidalnej liezbie chromosombw. Gen (Johannsen, 1909) - jednostka materiału genetycznego, zlokalizowana w chromosomie i definiowana jako podstawowa jednostka funkeji, rekombinacji oraz mutacji. 268 Gen kontrolujšcy - gen okreœlajšcy czas, czynnoœE lub stopień ekspresji genu strukturalnego. Gen letalny - gen, ktbry powoduje, że organizm jest niezdolny do życia. Gdy żywotnoœE organizmu jest tylko osłabiona, leez nie dochodzi do œmierci, wbwezas gen warunkujšcy ten stan jest zwykle nazywany półletalnym. Gen regulujšcy - gen decydujšcy o tym, czy geny strukturalne danego operonu podejmš transkrypeję lub translację. Gen strukturalny - gen determinujšcy pierwotnš strukturę (sekweneję aminokwasów) nowo tworzonego białka. Genetyka - nauka o informacji genetycznej, o ekspresji, czyli wyrażaniu się tej informacji, oraz o jej przekazywaniu do kombrek potomnych. Genetyka medyezna - dział genetyki człowieka zajmujšcy się zależnoœciš między czynnikami genetycznymi a ehorobš. Genom - wszystkie geny (stanu haploidalnego) danej komórki, organizmu lub gatunku. Genotyp - a) cała informacja genetyczna (zawarta w genach) danej kombrki, organizmu lub gatunku; b) informacja genetyczna w danym miejscu genowym. Genyaddytywne - geny wykazujšce współdziałanie, ale nie wykazujšee ani epistazy, ani dominacji. Najezęœciej geny te wpływajš na kształtowanie się cech iloœciowych. Haploid - komórka lub organizm z pojedynezym genomem, czyli haploidalnym 2estawem chromosomów, oznaczanym zwykle literš n. Hemizygotycznoœć - występowanie pojedynezych genów w genotypie diploidalnym, np. genbw chromosomu X u mężezyzny. Heterochromatyna - silnie barwišca się w okresie interfazy i skondensowana chromatyna. Heterozygotycznoœć - występowanie odmiennych alleli, w takich samych miejscach homologicznych chromosombw. Homozygotycznoœć - występowanie identycznych alleli, w takich samych miejscach homologicznych chromosomów. Hybryda ż., hybryd m. - wynik hybrydyzacji, czyli pomyœlnego skrzyżowania lub połšczenia dwbeh odmiennych genetycznie osobników. Idiotyp - całkowita suma dziedzicznych determinant obejmujšcych genotyp (determinanty zlokalizowane w chromosomach jšdra komórkowego) oraz plazmotyp (determinanty pozajšdrowe). Indukeja genu lub operonu - proces uruchamiajšcy ekspresję pojedynezego genu lub szeregu genów wehodzšcych w skład operonu. Interfaza - częœE cyklu życiowego komórki, zawarta między ukońezeniem jednego a poczštkiem następnego podziału. Interferon - swoiste drobnoczšsteczkowe białko o aktywnoœci przeciwwirusowej, produkowane przez kombrki zakażone aktywnymi lub nieaktywnymi DNAlub RNA-wirusami. Synteza interferonu jest indukowana przez genom zakażonej kombrki-gospodarza jako synteza de novo. Mechanizm dzialania interferonu polega na zahamowaniu syntezy czšstek wirusa (białka i kwasu nukleinowego) we wezesnym okresie replikacji wirusa w kombrce gospodarza. Intron - odcinek genu zawierajšcy nukleotydy nie ulegajšce transkrypeji w czasie syntezy białka. Insereja - wstawienie do sekweneji DNA, pojedynezych czy pewnej liczby par nukleotydbw. Inwersja - aberracja strukturalna w obrębie chromosomu, polegajšca na odwróceniu odcinka chromosomu, tak że geny zawarte w tym odcinku leżš w nim w porzšdku odwrotnym, niż to było pierwotnie. Inżynieria genetyczna - wprowadzenie do kombrek organizmu biorcy œciœle zde 269 finiowanego odcinka DNA dawcy, odpowiadajšcego jednemu lub kilku geno- mom bšdŸ jednostkom transkrypeji, w eelu trwałego zmienienia właœciwoœci biorcy. Izochromosom - aberracja strukturalna powstała wskutek nieprawidłowego, po- przecznego podziału centromeru chromosomu macierzystego, co daje w wy- niku izochromosomy składajšce się z dwu ramion homologicznych względem siebie - albo krótkich albo długich. Hariogram - zestaw chromosomów jednej dowolnie wybranej komórki. Kariotyp - zestaw chromosombw typowych dla danego osobnika, grupy osobników lub gatunku, uszeregowany według umownej zasady, np. zależnie od długoœci chromosomów, położenia centromeru itp. Klon- populacja komórek lub organizmów pochodzšcych od pojedynezej komórki lub wspólnego przodka drogš mitozy; reprodukeja klonu odbywa się bezpłciowo. Klonowanie - reprodukeja bezpłciowa grupy komórek lub całego organizmu z jednej, niezapłodnionej komórki. Kod genetyczny - zasada zapisu, czyli kodowanie sekweneji aminokwasowych w polipeptydach przez sekweneje nukleotydów w DNA i w RNA. Kodominacja - występowanie alleli, które nie sš zwišzane stosunkiem dominacji lub recesywnoœci; produkty tych alleli sš wytwarzane niezależnie i ujawniajš się fenotypowo. Kodon - triplet nukleotydów, który warunkuje włšczenie okreœlonego aminokwasu do okreœlonego miesjca w łańcuchu polipeptydowym. Kodon inicjaeyjny - kodon AUG (bšdŸ GUG), który na poczštku zapisu o syntezie polipeptydu w mRNA, stanowi sygnał do rozpoczęcia (inicjacji) syntezy polipeptydu. Hodony nonsensowne - trzy kodony: amber (UAG), ochre (UAA) i opal (UGA) nie rozpoznawane przez żaden rodzaj tRNA. Umieszezone na końcu zapisu o syntezie polipeptydu stanowiš kodony terminacyjne - powodujšce zakońezenie syntezy polipeptydu. Kodony terminacyjne - patrz kodony nonsensowne. Kompeteneja - zdolnoœE komórek bakteryjnych do podjęcia, zintegrowania i ekspresji informacji genetycznej, zawartej w wielkoczšsteczkowym DNA pokrewnych organizmów, czyli zdolnoœE do transformacji genetycznej w przebiegu różnicowania komórkowego. Homplementarnoœć - cecha charakterystyczna struktur, gdy jedna odpowiada dru#iej, np. w p#pad# DNA każda z cech wyznacza strukturę lub frakeję drugiej (dwa pasma w podwójnym łańcuchu DNA). W przypadku genów działanie ich jest komplementarne, jeœli na skutek ich interakeji dochodzi do powstania wspólnego efektu. Homplementarnoœć łaficuchbw w DNA (lub DNA i RNA) - występowanie w dwóch łańcuchach kwasów nukleinowych takich sekweneji nukleotydowych, które umożliwiajš paw#tanie podwójnej helisy, w której zasady G i C ora;# A i T(U) znajdujš się naprzeciw siebie. Letalnoœć - występowanie genu lub genotypu, których ekspresja prowadzi do œmierci ich nosicieli. Locus (loci) - miejsce (miejsca). Locus genetyczny - miejsce zajmowane przez gen w chromosomie lub na mapie chromosomalnej, oznaczone metodami cytologicznymi lub genetycznymi poprzez badanie rekombinacji genetycznej. Mapa chromosomalna - linearny zapis lokalizacji genów w chromosomie. Mapa genetyczna - graficzne przedstawienie pozycji zajmowanych przez geny 270 w chromosomie, ustalone na podstawie częstoœci rekombinacji lub za pomocš metod fizycznych. Mejoza - dwa sprzężone z sobš podziały komórek płciowych, w wyniku których powstajš komórki płciowe o haploidalnej liczbie chromosomów, tzw. gamety. Metafaza - stadium mitozy lub mejozy, w którym centromery wszystkich chromosomów znajdujš się w płaszczyŸnie równikowej wrzeciona kariokinetycznego. Miejsce genowe - patrz locus. Mitoza - podział komórek somatycznych, w wyniku którego powstajš dwie komórki potomne, majšce takš samš liczbę chromosomów i identycznš informację genetycznš jak komórka macierzysta. Monoploid - komórka lub organizm z pojedynczym haploidalnym zestawem chromosomów. Monosomia - aberracja liczbowa polegajšca na braku jednego (monosomia pojedyncza), dwóch (monosomia podwójna) lub kilku (monosomia wielokłotna) niehomologicznych chromosomów. Monozygotyzm - identycznoœE genotypbw oraz daleko posunięte podobieństwo fizyczne i behawioralne u bliŸništ powstałych z jednego jaja zapłodnionego jednym plemnikiem. Mozaika chromosomalna - obecnoœć w organizmie przynajmniej dwu linii komórkowych, o rbżnych liczbowo lub strukturalnie kariotypach, pochodzšcych od pojedynczej zygoty i powstałych w wyniku procesów przebiegajšcych już po zapłodnieniu. Mozaikowoœć - obecnoœć w organizmie komórek lub tkanek różnišcych się genotypem lub idiotypem. Mutacja - dziedziczna zmiana materiału genetycznego, która nie jest wynikiem ani segregacji, ani rekombinacji; dominujšce mutacje letalne nie sš przekazywane następnym pokoleniom. Mutacja nonsensowna - mutacja polegajšca na zamianie kodonu sensownego na kodon nonsensowny, przerywajšca translację, czyli syntezę pol#peptydu. Mutaeja punktowa - mutacja dotyczšca tylko jednej pary nukleotydbw #v DNA. Mutac„a zmiany sensu - mutacja polegajšca na zamianie kodonu sensownego na inny kodon sensowny, który oznacza inny aminokwas. mRNA - RNA matrycowy, czyli informacyjny, stanowišcy bezpoœredniš matrycę dla syntezy polipeptydu. Nierozdzielnoœć - brak rozdziału lub nierównomierne rozdzielenie się siostrzanych chromatyd (w czasie mitozy) lub homologicznych chromosomów (w czasie mejozy). Nukleazy - enzymy hydrolizujšce (depolimeryzujšce) kwas nukleinowy. Enzymy działajšce na DNA zwane sš dezoksyrybonukleazami (DNA-zami), a działajšce na RNA rybonukleazami (RNA-zami). Nukleazy atakujšce czšsteczki kwasbw nukleinowych od końców 3' i 5' zwane sš egzonukleazami, zaœ atakujšce czšsteczki wewnštrz łańcucha - endonukleazami. Ontogeneza - rozwój osobnika, poezšwszy od momentu powstania zygoty aż do œmierci. Ontogenezš nazywamy rozwój osobniczy a filogenezš - rozwój rodowy. Operator - odcinek operonu, leżšcy pomiędzy promotorem a genami strukturalnymi, do którego dołšcza się represor, co powoduje unieczynnienie operonu. Operon - układ genów strukturalnych i towarzyszšcych im odcinków DNA o funkcjach regulujšcych, ktbry umożliwia wspólne działanie genów wchodzšcych w skład operonu. Liczba genów strukturalnych wchodzšcych w skład różnych operonów może wynosić od jednego do kilkunastu. 271 Penetracja - przenikliwoœć, częstoœć, z jakš dominujšcy lub recesywny gen w sta-nie homozygotycznym, bšdŸ grupa genów, ujawnia się w fenotypie nosicieli. Plazmid - każda autonomicznie występujšca determinata dziedzicznoœci przenoszona niezależnie od chromosomów, w przeciwieństwie do episomów, które sš elementami genetycznymi połšczonymi z chromosomami. Pleiotropia - zjawisko warunkowania przez jeden gen kilku, pozornie nie zwišzanych ze sobš właœciwoœci fenotypowych. Poligenia - kontrola pojedynezej cechy fenotypu przez wieie współdziałajacych genów. Cechę takš okreœlamy jako poligenowš lub wielogenowš. Poliginia - połšczenie jednego męskiego i dwbeh lub więcej żeńskich jšder w isomórce jajowej. Polimorfizm genetyczny - regularne i jednoczesne występowanie w tej samej populacji dwbeh lub więcej odrębnych genotypów (bez form przej#eiowych), których obecnoœci nie można wytłumaczyć powtarzajšcymi się mutacjami. Polimorfizm chromosnmów - występowanie jednego lub kilku chromosomów, w obrębie danej populaeji, w #wu lub więcej wykluczajšcych się wzajeninie formach strukturalnych. Polipeptyd - łańcuch ponad dziesięciu aminokwasbw połšczonych wišzaniem peptydowym. Czšsteczka białka składa się z pojedynezego polipeptydu albo z kilku identycznych lub różnych polipeptydów. Poliploidia - obecnoœć więcej niż dwu kompletnych haploidalnych zestawów chromosomów, np. triploidia - 3#, tetraploidia - 4n, oktaploidia - 8n. Populacja - zbiór organizmów należšcych do jednego gatunku, występujšcych na okreœlonym obszarze oraz mogšeych krzyżować się między sobš i mieć potomstwo. Proband - przypadek wstępny - osoba, której dolegliwoœci lub anomalie zwróciły uwagę badacza na rodzinę lub/i spowodowały identyfikację rodziny jaka wykazujšcej ryzyko genetyczne. Prokarionty - bakterie i sinice - których komórki nie majš obłonionych jšder i organelli komórkowych. Przedstawiajš bardziej pierwotny poziom organizacji komórlsi niż eukarionty. Pseudoallel - każda z dwu flub więcej) mutacji, które sš alleliczne w sensie funkcjonalnym, ale nie strukturalnym. Pseurloallele zajmujš na mapie genetycznej rbżne pozveje i wykazujš mały stopień rekombinacji genetycznej. Takie mutacje u heterozygot ujawniajš się fenotypowo w pozycji trans, nabomiast nie ujawniajš sig w pozycji cis. Przeszezsp allo#eniczny - homologiczny, przeszezep od osobnika tego samego ;atunku, lecz innego genotypowo. Przeszezep autogeniczny - autoprzeszezep, przeszezep w obrębie tego samego osobnika. Przeszezep heterogen#czn y - ksenogeniczny, przeszezep od dawcy jednego gatunku do biorcy innego gatunku. Rasa - grupa w obrębie gatunku, ktbra stanowi populację lub zespół populacji, charakteryzujšca się okreœlonš częstotliwoœciš genów. Recesywna - okreœlenie cechy lub warunkujšcego jš allelu, którego działanie uwidacznia się dopiero u homozygot. Regu,latorowy gen - kodujšcy białko represorowe (lub inne białko regulacyjne), kontrolujšce ekspresję genu lub zespołu genów (operonu). Rekombinaej2 - proces prowadzšcy do powstania chromosomów, komórek lub orgarrizmbw, ła.czšcych dwie lub więcej cech (genów), pod wzgl4dem których różnili się ich "rodzice". Renaturacia DNA - tworzenie się dwuniciowej helisy DNA, odwrotnoœć procesu denaturacji. Reperacja DNA - protes enzyxnatyczny polegajšcy na usuwaniu wsz#lkich uszkodzeń DNA, powstałych sponhanicznle lub w wyniku działania mutagenów. 212 gœeplikacja DN# - proces syntezy nowych łańcuchów DNA na matrycy, którš sta# nowiš stare łańcuchy. Restrykeja - zjawisko polegajšce na przecinaniu obcego, np. wirusowego, DNA; przez enzymy restrykcyjne. HNA - kwas rybonukleinowy, polimer złożony z rybonukleotydów; od DNA różni się występowaniem rybozy (zamiast dezoksyrybozy) i uracylu (zamiast tyminy), oraz jednołańcuchowoœciš ze zdolnoœciš tworzenia niei komplementarnej do DNA. Segregacja - rozdzielenie się alleli danej pary i przejœcie ich do różnych komórek potomnych, co następuje podezas mejozy, a czasem również mitozy (w wyniku mitotycznego crossing-over). Selekeja (áarwin, 1858) - zróżnicowanie i niegrzypadkowe odtwarzanie różnych genotypów; najbardziej istotny czynnik ewolucji, powodujšcy kierunkow# zmiany frekweneji genów i genotypów w populacji. Socjobiologia - nauka badajšca biologiczne podstawy wszelkich zachowań socjalnych. Sprzężenie (Morgan, 1910) - łšezne przekazywanie genów i uwarunkowanych przez nie cech fenotypowych, spowodowane tym, że geny te sš zlokalizowane blisk# siebie w tym samym chromosomie lub w czšsteczce Iswasu nukleinowego. Spr#ężenie z płciš (Morgan, 1914) - geny (i uwarunkowane przez nie cechy fenotypowe) umiejscowione w chromosomaeh płciowych, okreœlamy jako sprzężone z płciš. łeratogeny - czynniki œrodowiskowe powodujšce powsianie z#:b-#irzeń roz#vojowycl# u płodu. Transdukeja - przeniesienie informacji genetycznej z jednej bakterii do innej z# poœrednictwem wirulentnych lub umiarkowanyc?z bakteriofagów,. Transformacja - przeniesienie informacji genetycznej w postaei fragmentu DiVA z jednej komórki do drugiej oraz zintegrowanie jej z genomem komórk:. Transformacja nowotworowa - zmiana komórki normalnej w nowotworowa, ng. w wyniku integracji do chromosomu DNA wirusa onkogennego. Transkrypeja (#rzepisanie) - biosynteza mRNA na odcinku DNA; umożliwia przekazywanie informacji genetycznej zakodowanej w DNA na mRNA. Translacja (przekład) - biosynteza łańeLacha peptydowego, którego struktura I-rzędowa wyznaczana jest sekwenejš nukleotydów mftNA. '#ranslokacja - przemieszezenie odcinka chromosomu w nowe położenie alba w obrębie tego samego chromosomu (tra.nslokacja wewnętrzna), albo z jednego chromosomu do drugiego. Transłokacja robertsonowska - połšczenie centryczne ramion długich dwóch akrocentrycznych chromosomów; jest ona zwykle translokacjš zrównoważonš. Translokacja zrównoważona - translokacja nie powodujšca zmian w fenotypie: Triploidia - obecnoœe trzech haploidalnych zestawów chromosomów. Trisomia - obecnoœć trzech homologicznych chromosoznów. tftNA - przenoœnikowy RNA przenoszšcy aminokwasy w proces:e translacji: Uwarunkowanie eechy - wystšpienie ceehy zależy albo od jednej pary alleli (u#va-runkowanie jednogenowe), albo od wielu genów (uwarunkowańie wielogenowe), 1ub także od czynników œrodo###skowych (uwarunkowanie wieloczyn= nikowe). 1B - Zarys genetyki Wariancja - miara zmiennoœci zbioru. Jest to suma kwadratów odchyleń poszczególnych elementów zbioru od jego œredniej. Wariancja ma właœciwoœci addytywnoœci i można jš rozkładaE na poszczególne elementy, np. wariancja eałkowita jest sumš wariancji genetycznej i œrodowiskowej. Pierwiastek z wariancji jest to odchylenie standardowe. #Vielogenowa cecha - patrz poligenia. Wrodzona cecha lub wtaœciwoœć - istniejšca w chwili urodzenia. Może być spowodowana zarówno czynnikami teratogennymi, jak i genetycznymi, przy ezym nie obejmuje wszystkich stanów uwarunkowanych genetycznie (które mogš ujawnić się dopiero w wieku póŸniejszym). Zygota - komórka diploidalna powstała w wyniku połšczenia się dwóch #amet; zapłodniona komórka jajowa. Po przeczytaniu Słownika porównaj następujšce terminy: Allel Aneuploidia Biotyp Chromatyda Cialko Barra Delecja Dominacja Dziedziczny Egzon Episom Euchromatyna Fenotyp Filogeneza Gameta Gatunek Gen Gen Genetyka Haploid Homozygotycznoœć Hybryda Idiotyp Kariogram Kodon Mitoza Monosomia Mutacja Penetracja Replikacja Sprzężenie Transdukcja Trisomia Gen Euploidia Genotyp Chromatyna Ciałko Y Duplikacja Kodominacja Wrodzony Intran Plazmid Heterochromatyna Fenokopia Ontogeneza Zygota Rasa Cecha Genom Cytogenetyka Monoploid Heterozygotycznoœć Chimera Genotyp Kariotyp Kod g##netyczny Mejoza Trisomia Selekcja Ekspresja Renaturacja Asocjacja Transkrypcja Triploidia Chromosom Translokacja Recesywnoœć Populacja Poligenia Genotyp Eugenika Diploid Hemizygotycznoœć Mozaika chromosomalna Plazmotyp Idiogram Interfaza Dryf genetyczny Restrykcja Sprzężenie z płciš Translacja Pleiotropia Socjobiologia Poliploid Mozaikowoœć Translokacja